医学分子生物学（全套课件633p）

医学分子生物学,Medical Molecular Biology,第一章 绪 论 Introduction,第一节 分子生物学和医学分子生物学研究的主要内容 一、分子生物学的主要内容 （一）生物大分子核酸和蛋白质的结构与功能 （二）基因组的结构与功能 （三）基因组的复制、表达和调控 （四）生物大分子的互相作用 （五）细胞信号转导 （六）分子生物学技术,二、医学分子生物学的主要内容 （一）人体发育、分化和衰老的分子生物学基础 （二）细胞增殖的分子基础 （三）人体三大功能调控系统（神经、内分泌和免疫）的分子生物学基础 （四）基因的结构异常或表达异常与疾病的关系,（五）应用分子生物学技术进行基因诊断、基因治疗、生物制药和卫生防疫。,第二节 分子生物学的发展史 一、分子生物学的形成 二、分子生物学的发展 第三节分子生物学在医学中的应用 一、人体发育调控和人体功能调控的 分子生物学基础 二、基因与疾病 三、生物工程与生物制药 四、预防医学,第三章 基因组的结构与功能 Structure and Function of Genome,基因（gene)： 是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，是贮存蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。,基因组（genome）： 细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和称为基因组。,结构基因（structural gene）： 是指能转录生成RNA或编码多肽链的DNA序列。 假基因（pseudogene）： 是指与功能正常的基因序列相似，但无转录功能，或转录产物无功能的基因。,断裂基因（split gene）： 又称为不连续基因，即由内含子（非编码序列）和外显子（编码序列）组成的基因。 多数真核生物基因为断裂基因。,非剪接基因（non-splicing gene）： 又称为连续基因，即无内含子序列的基因，转录产物无须剪接，可直接用来翻译合成蛋白质。 原核生物基因和少数真核生物基因为非剪接基因。,重叠基因（overlapping gene）： 相邻两个或几个基因之间在序列上有重叠现象，这种基因称为重叠基因。 基因家族（gene family）： 功能相关的基因构成各种基因家族 。,第一节 病毒基因组 Virus Genome,病毒（Virus）的组成,病毒 virus,核衣壳 nucleocapsid,包膜（来自宿主细胞膜） envelope,核酸 Nucleic acid,衣壳 capsid,DNA,RNA,（由蛋白质 排列构成）,病毒（Virus）的结构,球状病毒的衣壳多具有二十面对称结构,病毒衣壳二十面对称结构,Schematic diagram of human immunodefiency virus（HIV）,包膜蛋白,包膜,核酸,衣壳,核衣壳,杆状病毒衣壳为螺旋对称结构,RNA,Protein subunit,烟草mosaic 病毒,一、病毒基因组核酸的主要类型,双链DNA 单股正链DNA 双链RNA 单股负链RNA 单股正链RNA,1、双链DNA,环状DNA,线状DNA,这类病毒基因组DNA复制的类型：,（1）通过DNA复制过程完成基因组复制。大多数DNA病毒基因组属这种类型。,（2）先转录生成RNA中间体，然后再通过逆转录过程完成基因组的复制。如乙肝病毒（hepatitis B virus , HBV）。,核酸分子的正链与负链： 序列与mRNA相同的核酸链，称为正链；与mRNA互补的核酸链，称为负链。,GAATCGTTACCGCGCATAGTTGGC CTTAGCAATGGCGCGTATCAACCG,GAAUCGUUACCGCGCAUAGUUGGC,mRNA,DNA,负链,正链,CUUAGCAAUGGCGCGUAUCAACCG,负链RNA,HBV-DNA的复制机制,正链,负链,线状双链DNA,带有部分单链区 的环状双链DNA,共价闭环双链DNA,闭环,以负链 为模板 进行转录,翻译合 成核 衣壳 蛋白,逆转录,前基因组RNA,核衣壳,RNA 酶H,也可整合入宿 主细胞染色体中,2、单链正股DNA,这类病毒包括自主微小病毒、依赖微小病毒、M13噬菌体。,解链,复制,复制,正股 DNA,负股DNA,双股DNA,正股DNA,复制,翻译,病毒 蛋白质,转录,RNA,包装成 病毒颗粒,负链,正链,可降解,负股DNA,正股DNA,特点： 进入宿主细胞后复制形成双链，并通过DNA复制过程完成基因组的复制；,其基因转录方式类似于真核细胞，即以负链为模板转录生成mRNA。,3、双链RNA 动物呼肠孤病毒和各种噬真菌体属于这类病毒。,CUUAGCAAUGGCGCGUAUCAACCG,GAAUCGUUACCGCGCAUAGUUGGC,特点：通过RNA复制过程完成基因组的复制； 以负链RNA为模板转录生成mRNA。,4、单链负股RNA,特点：进入宿主细胞后复制形成双链RNA，并通过RNA复制过程完成基因组的复制； 复制形成的正链RNA无5帽和3polyA结构，不能作为合成蛋白质的模板；以负链RNA为模板转录生成带有5帽和3polyA的mRNA，可翻译生成病毒蛋白质。,5、单链正股RNA,这类病毒基因组的复制和转录机制有两种： （1）通过RNA复制过程完成基因组的复制；正股RNA既可以作为mRNA，翻译合成蛋白质，也可以包装形成病毒颗粒。 （2）通过DNA中间体完成基因组复制。,转录,逆转录,复制,整合,翻译合成 病毒蛋白质,包装形成 病毒颗粒,病毒 RNA,cDNA,双链 DNA,宿主 DNA,前病毒,二、病毒基因组结构与功能的特点,1、不同病毒基因组大小相差较大,病毒 基因组大小（kb）,RNA病毒 小RNA病毒科 7.28.4 披盖病毒科 12 黄病毒科 10 DNA病毒 乙肝病毒 3.2 痘病毒 300,2、不同病毒基因组可以是不同 结构的核酸,病毒 基因组的类型,乳头瘤病毒 闭环双链DNA SV40病毒 闭环双链DNA 腺病毒 线状双链DNA 疱疹病毒 线状双链DNA 噬菌体M13 单链环状DNA 脊髓灰质炎病毒 单链RNA 呼肠孤病毒 双链RNA,3、病毒基因组有连续的也有 不连续的,病毒 基因组 核酸分子 连续性 数目,DNA病毒 连续 1 冠状病毒 连续 1 小噬菌体Q 连续 1 流感病毒 不连续 8 呼肠孤病毒 不连续 10,4、病毒基因组的编码序列 大于90% 5、除逆转录病毒基因组有两个拷贝外，其他病毒基因组都是单倍体。,HIV,6、病毒基因有连续的和间断的,间断基因,连续基因,内含子,外显子,编码病毒的各种衣壳蛋白基因,7、相关基因丛集,转录,转录后加工,多顺反子mRNA,mRNA,8、基因重叠,A基因,B基因,9、病毒基因组含有不规则结构基因 （1）几个结构基因的编码区无间隔； （2）mRNA没有5端的帽子结构； （3）结构基因本身没有翻译起始序列。,三、典型病毒基因组介绍 （一）SV40病毒（猴空泡病毒40）基因组,晚期转录区,早期转录区,T,t,VP1,VP3,VP2,Ori,SV40病毒 基因组,早期基因 转录区,晚期基因 转录区,T抗原基因 t抗原基因,VP1 VP2 VP3,调控区,复制起始点 启动子 增强子,（二）乙型肝炎病毒（hepatitis B virus , HBV）基因组,HBV基因组是由正负两条链组成的带单链区的环状DNA分子，分子中的重要成分有： 1、顺向重复序列（DR）:DR1,DR2 2、S区段：S基因、前S1基因、前S2基因 3、C区段：编码HBcAg 4、P区段：编码逆转录酶（依赖RNA的DNA聚合酶） 5、X区段：编码的X蛋白功能不详,DR2,DR1,TP,Primer,()strand,(+)strand,Pres1,Pres2,S,P,polyA,PreC/C,X,Pres1,Pres2/5,RC,PreC,C,X,（三）逆转录病毒基因组,5-帽-R-U5-PB-DLS- gag-pol-env-(onc)-C-PB+ -U3-R-poly(A)n- 3 ,HIV-1,HIV-2,pro,gp120,5-,pol,int,gp41,-3,LTR,gag,RNase H,vpt,vif,tat,vpu,tat,rev,LTR,nef,pol,pro,gp120,5-,pol,int,gp41,-3,LTR,gag,RNase H,vpx,vif,vpr,tat,rev,LTR,nef,pol,env,RRE,env,第二节 原核生物基因组 Prokaryote Genome,一、原核生物基因组结构 与功能的特点 1、基因组通常仅由一个环状 双链DNA分子组成；,大肠杆菌染色体的类核结构,环状DNA,类核中央,2、基因组中只有一个复制起始点；,双向复制,3、具有操纵子结构,I,P,O,Z,Y,A,I mRNA,I,P,O,Z,Y,A,阻遏蛋白,I mRNA,RNA 聚合酶,-半乳 糖苷酶,乳糖 透性酶,半乳糖苷 乙酰化酶,多顺反子mRNA,4、编码顺序一般不会重叠,只有 少数基因存在重叠现象； 5、基因是连续的，无内含子； 因此，转录后不需要剪切； 6、编码区在基因组中所占比例 （约50%）远远大于真核生物基 因组，但又远远小于病毒基因组； 非编码区主要是一些调控序列；,7、基因组中重复序列很少； 8、具有编码同工酶的基因； 9、存在可移动序列，包括插入 序列和转座子； 10、具有多种功能的识别区域， 如复制起始区、复制终止区、转 录起始区、转录终止区等。,二、质粒（plasmid） （一）概念：质粒是细菌细胞内携带的染色体外的能独立进行复制的环状DNA分子。,（二）质粒的遗传控制 1、复制调控系统：控制质粒的拷贝数。,Ori rep基因 cop基因,复制调 控系统,2、分配系统：使质粒在细菌细胞分裂过程中精确分配到子细胞中。质粒中发挥这种作用的区域称为分配区。 3、细胞分裂控制系统：抑制细胞分裂，使细胞分裂与质粒复制协调，避免太多不含质粒子细菌出现。,4、位点特异重组系统：控制质粒在细菌细胞内的多聚体与单体相互转变过程。,位点特异 重组系统,att位点,Int酶,Xis酶,FIS因子,IHF因子,质粒自 身提供,宿主提供,5、质粒的不相容性：具有相同复制起始点和分配区的两种质粒不能共同存在于同一个细菌细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。,（三）质粒的类型 1、接合型质粒、可移动型质粒和自传递质粒 2、严谨型质粒和松弛型质粒 3、窄宿主谱质粒和广宿主谱质粒,三、转位因子（transposable element） （一）概念： 转位因子，即可移动的基因成分，是指能够在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的DNA片段。在细菌中，则指可在质粒和染色体之间或在质粒和质粒之间移动的DNA片段。,（二）转位因子的类型及其特征,转位因子,插入序列 转座子 可转座的噬菌体,1、插入序列 （insertion sequence , IS） 特征： （1）是一类较小的没有表型效应的转座因子，长度约7002000bp； （2）由一个转位酶基因和两侧的反向重复序列（inverted repeat sequence,IR）组成； （3）可双向插入靶位点，在插入后的两侧可形成顺向重复序列（direct repeat sequence ,DR）,插入序列,IR,IR,转位酶基因,IR,-GAATTCGGCTTAAG- -CTTAAGCCGAATTC-,-GAATTCGGAATTCG- -CTTAAGCCTTAAGC-,DR,2、转座子（transposon,Tn ） （1）特征： 是一类较大的可移动成分； 含有关转座的基因，如转座酶； 带有一个或几个与转座作用无关的但可决定宿主菌遗传性状的基因，如大肠杆菌毒素基因、抗药性基因等。,（2）类型 复合型Tn,IR或 类IR,转座酶 基因,两侧臂结构,基因序列,TnA族,转座酶 （TnpA）,阻遏和解 离蛋白质 （TnpR）,-内 酰胺酶,反向序列,内解离区,Tn3的结构,接合型Tn 一类可以在细菌间通过接合进行转移的Tn； 无末端反向重复序列，转座后不产生顺向重复序列； 转座方式类似-噬菌体整合的专一性重组。,3、可转座的噬菌体（transposable phage） 是一类具有转座功能的溶源性噬菌体。,（三）转位作用的机制,受体 DNA,供体 DNA,靶位点,转座子,第三节 真核生物基因组 Eukaryote Genome,一、真核生物基因组结构与功能的特点 1、每一种真核生物都有一定的染色体数目，除配子（精子和卵子）为单倍体外，体细胞一般为双倍体；如: 果蝇 8条（4对） 小鼠 40条（20对） 人 46条（23对）,2、真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每个复制子大小不一；如： 大肠杆菌DNA全长4.6106bp，含4000个基因。 人类染色体单倍体DNA全长3109bp，含34万个基因。,3、真核生物基因都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子；,内含子,外显子,启动子,增强子,5-UTR,3-UTR,增强子,真核生物 结构基因及其主要调控元件 UTR:非编码区；增强子可以位于基因的上游或下游较远处,4、真核生物基因组中含有大量重复序列； 5、真核生物基因内非编码序列占90%； 6、真核生物基因大多数为断裂基因； 7、功能相关的基因构成各种基因家族 8、真核生物基因组中也存在可移动的遗传因素转座子。,二、真核生物基因组的结构,结构基因,顺式调控元件,基因家族,重复序列,转座子,端粒,（一）结构基因断裂基因,内含子,外显子,hnRNA,mRNA （单顺反子）,转录,转录后加工,（二）顺式调控元件（cis-acting elements）,启动子 上游启动子元件 增强子 沉默子（负增强子或抑制子） 反应元件 加尾信号,1、启动子（promoter） （1）启动子是RNA聚合酶特异识别和结合的DNA序列，位于基因转录起始点的上游，具有启动基因转录的作用，但本身不被转录。 （2）真核生物基因启动子原件TATA盒。 （3）上游启动子元件CAAT盒、 CACA盒、 GC盒等。,2、增强子（enhancer） （1）DNA中某些序列与相应的反 式作用因子结合后，可增强启动子的作用，提高基因的转录活性，这些序列被称为增强子。 （2）增强子可位于结构基因的上游或下游，距离启动子可远可近，其作用通常与方向和距离无关。,（3）没有增强子，启动子通常无活性；没有启动子，增强子也无法发挥作用。 （4）通常可决定基因表达的时间特异性和组织细胞特异性。,3、负增强子（negative enhancer）或沉默子（silencer） DNA中某些序列与特定的反式作用因子结合后，可抑制启动子的作用，降低基因转录活性，这些序列被称为负增强子。,4、反应元件（response elements） 一些信息分子的受体被细胞外信息分子激活后，能与DNA的特异序列结合，调控基因的表达。这种特异的DNA序列被称为反应元件。如： 热休克反应元件 （heat shock response elements） 糖皮质激素反应元件 （glucocorticoid response elements）,5、加尾信号,AAUAAA,(GU或U)n,加尾信号,（三）基因家族（gene family） 类型： 1、核酸序列相同。如rRNA基因 家族、tRNA基因家族、组蛋 白基因家族等。 2、核酸序列高度同源。如人类生 长素基因家族。 3、编码产物具有同源功能区。如 src癌基因家族。,4、编码产物具有小段保守基序。 如DEAD（Asp-Glu-Ala-Asp） 盒基因家族。 5、基因超家族 （gene superfamily）。 如免疫球蛋白基因超家族。,（四）重复序列 1、高度重复序列：重复次数105 类型： 卫星DNA 反向重复序列 2、中度重复序列： 重复次数10105 如rRNA基因、tRNA基因、组 蛋白基因、免疫球蛋白基因等。,3、单拷贝序列：仅出现一次或少 数几次。,（五）转座子,转录,逆转录,整合,逆转录转座子,（六）端粒,端粒区,端粒下区,着丝点,端粒区,端粒下区,染色体,GGG(TTAGGG)n,CCC(AATCCC)n,人DNA端粒结构,重复单位,重复次数,GGGTTA,AAUCCCAAU,GGGTTAGGGTTA,AAUCCCAAU,GGGTTAGGGTTA,AAUCCCAAU,GGGTTAGGGTTAGGGTTA,AAUCCCAAU,5,3,端 粒 酶 作 用 机 理,三、人类基因组的组织结构特征,人类基因组具有上述真核基因组的基本结构特点。此外，最为突出的特征是： 基因组的DNA总量约3109，其中编码序列占5%以下，非编码序列占95%以上。 非编码序列中存在大量重复序列。 人类基因组的DNA序列多态性,（一）人类基因组的重复序列,反向重复序列,串联重复序列,散在重复序列,1、反向重复序列 （inverted repeats）,AGCTAGTACATGCATGCGTACTAGCT TCGATCATGTACGTACGCATGATCGA,反向重复序列 （中间无间隔的又称为回纹结构）,C A,G T A,G T A C T A G C T,T G C,C A T G A T C G A,A G C T A G T A C,T C G A T C A T G,T A C,G T,G C A,反向重复序列易形 成链内碱基配对而 呈“发夹”式或“+” 字形结构,2、串联重复序列 （tandem repeats） 重复序列的重复单位成串排列。 （1）编码区串联重复序列 如组蛋白基因。,ACAATT-ACAATT-ACAATTACAATT,（2）非编码区串联重复序列 大卫星DNA 小卫星DNA 微卫星DNA,3、散在重复序列 Interspersed repeats （1）短散在重复序列（short interspersed nuclear elements, SINEs）。如Alu家族（灵长类特 有）。 （2）长散在重复序列（long interspersed nuclear elements, LINEs）。如Kpn家族。,（一）人类基因组的DNA多态性 同种生物的不同个体之间基 因组DNA序列的差异性，称为基 因组DNA的多态性。 1、位点多态性 （DNA site polymorphism） 位点多态性也称为基因多态性，即指在人群中的同一基因位点上有多个等位基因。,2、限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphism,RFLP） 由于DNA多态性可引起某种限制性内切酶酶切位点的消失或新位点出现，因此应用同一种限制性内切酶消化不同个体的DNA时，会得到长度各不相同的限制性酶切片段类型。这种现象称为限制性片段长度多态性。,Mst,A,B,1.3kp,1.1kp,0.2kp,Marker,3、串联重复多态性 （tandem repeat polymorphism） （1）小卫星DNA多态性 （2）微卫星DNA多态性,第八章 基因工程 Genetic engineering,DNA重组： 不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接而形成重新组合的DNA分子的过程，称为DNA重组（DNA recombination）。,基因工程的概念： 按照既定的目的和方案，把目的基因片段与载体DNA连接形成重组DNA分子，然后将其导入宿主细胞，并对含有目的基因的细胞进行克隆，最后利用克隆的基因表达、制备蛋白质或多肽，或定向改造细胞乃至生物个体。这种技术方法称为基因工程。,基因工程的基本过程：,目的基因的制备 载体的制备 目的基因与载体的连接 重组DNA分子导入宿主细胞 含目的基因细胞的筛选和鉴定,第一节 工具酶,工具酶,限制性内切核酸酶,DNA聚合酶 （Klenow片段） 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酰转移酶 Taq DNA聚合酶和其它 耐热DNA聚合酶,修饰酶,一、限制性内切核酸酶 （一）概念 限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）是指能识别双链DNA分子内部特异位点并在识别位点或附近水解磷酸二酯键的一类内切核酸酶，简称为限制酶（restriction enzyme）。,（二）限制酶的分类 限制酶：通常在识别位点下游1001000bp处切割DNA，切割位点难以预测。 限制酶：在识别位点切割DNA，切割位点固定，序列可知。 限制酶：在识别位点附近切割DNA，切割位点难以预测。,（三）限制酶的命名,命名规则： 用来源细菌的英文缩写斜体符号命名。它的第一个字母大写，代表细菌的属名；第二、三字母小写，代表细菌的种名；第四个字母代表菌株；最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号。,名 属 种 株 序 来源 称 名 名 名 号 菌株 EcoR E co R Escherichia coli R Hind H in d Haemophilus influenzae d Hind H in d Haemophilus influenzae d Hpa H pa / Haemophilus parainfluenzae,（三）限制酶的识别和切割位点 特点： 1、通常是由46个碱基对组成的具有回纹序列的DNA片段；,5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5,2、大多数限制酶是错位切割双链DNA，产生5或3粘性末端；,5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5,5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5,EcoR,5粘性末端,5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5,5-CTGCA G-3 3-G ACGTC-5,Pst,3粘性末端,3、部分限制酶沿对称轴切割DNA双链，产生平端。,5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5,5-CCC GGG-3 3-GGG CCC-5,平端,Sma,（四）同功异源酶 来源不同但能识别和切割同一位点的限制酶。,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,Bam H和Pst 的共同识别位点,（五）同尾酶 有些限制酶识别序列不同，但可产生相同粘性末端，这些酶称为同尾酶。,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,5-G GATCC-3 3-CCTAG G-5,Bam H,5-NGATCN-3 3-NCTAGN-5,5-N GATCN-3 3-NCTAG N-5,Sau 3A,二、修饰酶 （一）DNA聚合酶 Klenow片段的用途： 1、补齐双链DNA的3末端； 2、双链DNA3末端的标记； 3、在cDNA合成中，第二链的合成； 4、DNA序列的分析。,（二）逆转录酶 主要用于cDNA的合成，构建cDNA文库。 （三）T4DNA连接酶 （四）碱性磷酸酶 （五）末端脱氧核苷酰转移酶 （六）Taq DNA聚合酶和其它耐热DNA聚合酶,第二节 载体 vector,载体（vector）,载 体,克隆载体,表达载体,质粒 噬菌体 粘性质粒 M13噬菌体,大肠杆菌表载体 酵母菌表达载体 哺乳动物表达载体,一、克隆载体,（一）质粒（plasmid）,质粒（plasmid） 概念：质粒是细菌细胞内携带的染色体外的能独立进行复制的环状DNA分子。,质粒的特性 （1）寄生性 （2）稳定性 （3）自主复制性 （4）传递性 （5）表型效应 （6）不相容性 （7）重组性 （8）可消除性 （9）分子量较小,组建理想载体的质粒应具备的特点： 1、分子量较小。 2、拷贝数较高。 3、具有可供选择的遗传标记。 4、具有多个限制酶的单一切点（多克隆位点）。 5、具有复制起始点。,Hind,EcoR,Bam,Hind,Mst,多克隆位点 Multiple cloning sites,常用的克隆质粒载体: pBR322 pUC系列 pGEM系列,pUC18 pUC19,pBR322 4363bp,Apr,Tcr,ori,Apr,Lacl Z,pUC18,Hind,EcoR,图 15-7 质粒 pUC19,396,（二）噬菌体,噬菌体（bacteriophage）,溶菌性,溶源性,体,噬菌体,衣壳蛋白基因,整合和重组基因,粘性末端,粘性末端,调控区,插入型载体 置换型载体,两类噬菌体载体,适用于建立cDNA基因文库的噬菌体载体： gt10 gt11 这两种载体属于插入型载体。,CI,43.3kb,gt10,LacZ,43.7kb,gt11,（三）粘性质粒 1、构成：由噬菌体的cos区和质粒构成。 2、特点： （1）带有抗药性基因，如Ampr、Tctr （2）带有cos区 （3）具有一个或多个限制酶酶切位点。,（4）分子量较小，但能容纳较大的DNA片段。 （5）粘性质粒较小，体外不能包装，但其重组体可体外包装。,（四）M13噬菌体 单链DNA 用于序列分析,二、表达载体（expressing vector） 表达载体是用来在受体细胞中表达外源基因的载体。表达载体常由克隆载体改造而来。 常用表达载体的受体细胞： 原核细胞 大肠杆菌、分支杆菌、放线菌等； 真核细胞 酵母菌、哺乳动物细胞、人体细胞。,（一）大肠杆菌表达载体 大肠杆菌表达载体应有的结构成分： 复制起始点 抗性基因 多克隆位点 表达系统元件,表达系统元件：,P,RBS,启动子,核糖体结合位点,MCS,TS,多克隆位点,终止信号,1、启动子（promoter） 大肠杆菌表达载体中常用的启动子： （1）trp-lac启动子（又称tac启动子） tac启动子是一种人工构建的双杂合启动子，由trp启动子、lac操纵子的操纵基因和SD序列融合而成。受lac阻遏蛋白的抑制，异丙基硫代半乳糖苷的诱导表达。,（2）噬菌体PL启动子 特点：受温度的控制，低温（37C）下被阻遏而抑制，高温（42 C）下去阻遏而激活。 （3）T7噬菌体启动子,2、核糖体结合位点（ribosome-binding site , RBS） RBS由SD序列、核糖体识别序列和起始密码（ATG）组成。 但有时也将SD序列称为核糖体结合位点。,A CACUAGG U C UCCU AGGAPuPuUUUUPuPuAUG,3,5,核糖体小亚基的16SrRNA,5,3,mRNA,SD 序列,核糖体小亚 基识别序列,起始 密码,SD：Shine-Dalgarno，人名 SD序列：AGGA或 AGGAGG,3、转录终止序列 一般由一段GC富集区组成的反向重复序列，具有回纹结构，转录产物的对应区可行成“发夹”结构。 转录终止机制有两种： 依赖因子的转录终止 不依赖因子的转录终止,DNA,转录产物RNA,因子,RNA 聚合酶,RNA 聚合酶,DNA,转录产物RNA,UUU,UUU,AAA,AAA,（二）哺乳动物表达载体 哺乳动物表达载体应有的结构成分： 原核细胞克隆载体应有元件 真核生物复制起始点 选择标记性基因 真核表达元件,真核表达元件,启动子 /增强子,多克隆 位点,终止 信号,加尾 信号,1、启动子和增强子 原核生物启动子和增强子在哺乳动物细胞内不起作用。真核表达载体必须有真核启动子和增强子。 常用的有：,（1）病毒源启动子和增强子 SV40病毒早期基因启动子和增强子 Rous肉瘤病毒基因长末端重复顺序。 人类巨细胞病毒启动子 腺病毒晚期基因启动子,（2）真核细胞源启动子和增强子 肽链延长因子基因启动子 -肌动蛋白启动子 热休克蛋白启动子 肌酸激酶启动子 金属硫蛋白启动子,2、终止信号和加尾信号 真核细胞的转录终止终止机制是转录越过修饰点后，在修饰点处切断，随即加入polyA。 基因工程中最常使用的加尾信号序列来自于SV40病毒。,AAUAAA,(GU或U)n,转录终止 修饰点,第三节 重组DNA技术 的基本过程,重组DNA技术的基本过程,制备目的基因 选择和制备载体 目的基因与载体的连接 将重组DNA分子导入宿主细胞 筛选和鉴定目的基因 目的基因的克隆和表达,一、目的基因的制备 （一）用基因组DNA制备目的基因 1、建立基因组文库 基因组文库的概念：首先用限制酶将基因组DNA切成片段，再把每一DNA片段都与一个载体连接成重组DNA分子。将所有的重组DNA都转移入宿主细胞内并进性扩增，得到分子克隆的混合体。这一混合体称为基因组文库。,提取基因组DNA,限制酶酶切基因组DNA,酶切DNA片段与质粒载体连接,转移入大肠杆菌进行克隆,2、从基因组文库中获取目的基因,从细胞中分离高分子量DNA,限制酶消化,分离所需要的DNA片段,（二）mRNA逆转录生成的cDNA作为目的基因 1、建立cDNA文库 cDNA 文库的概念： 首先把细胞中分离出的所有mRNA逆转录成各种cDNA，再把每一cDNA都与一个载体连接成重组DNA分子。将所有的重组DNA都转移入宿主细胞内并进性扩增，得到分子克隆的混合体。这一混合体称为cDNA文库。,从细胞中分离出mRNA,逆转录生成cDNA,与载体连接成重组DNA,转移入大肠杆菌进行克隆,合成双链DNA,逆转录酶,T4DNA聚合酶,2、从cDNA文库中获取目的基因,从细胞中分离重组DNA,限制酶消化,分离所需要的DNA片段,（四）制备用于表达的基因片段 1、直接用限制酶切取 从基因组DNA 从基因组文库 从cDNA文库 2、PCR体外扩增 3、化学合成,二、载体的选择和制备 三、目的基因与载体的连接 （一）粘性末端连接法,5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5,5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5,EcoR,DNA连接酶,连接酶,限制酶,（二）利用人工接头连接,限制酶,限制酶,连接酶,（三）加入同聚体尾连接,限制酶,GGGG CCCC,GGGG CCCC,GGGG CCCC,GGGG CCCC,末端转 移酶酶,G CCCC,GGGG C,G CCCC,GGGG C,GGGG CCCC,GGGG CCCC,限制酶,连接酶,（四）平端连接,限制酶,T4连接酶,四、重组DNA分子导入宿主细胞 常用方法 （一）转化（transformation） 概念：转化是指将质粒或其它外源DNA导入原核细胞的过程。 （1）CaCl2处理（制备感受态细胞）后转化 （2）电穿孔法（电击法）,（二）转导（transduction） 概念：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程称为转导。 噬菌体和粘性质粒体外包装法 （三）转染（transfection） 概念：外源DNA分子导入真核细胞的过程称为转染。,五、目的基因的筛选和鉴定 （一）遗传学方法 1、筛选转化菌 常利用质粒的抗生素抗性基因来筛选。,质粒载体（Ampr）+ 大肠杆菌 （含目的基因）,转化,已转化的 大肠杆菌,未转化的 大肠杆菌,在含氨苄青霉素 培养基中培养,生长,被杀死,2、筛选带有重组体的克隆 （1）插入灭活法,Ampr,Tetr,目的基因,Ampr,Te,tr,插入灭活四 环素抗性基因,pBR322,BamH,（2）-互补,-半乳糖苷酶,5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 （X-gal）,蓝色物质,多克隆位点,启动子,裂开的N端,裂开的N端,外源DNA, 半乳糖苷酶N端编码序列,pUC18 2686bp,pUC18 2686bp,染色体,重组体pUC18,细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养,细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养,pUC18,含重组体pUC18的白色菌落,蓝色菌落,含载体pUC18的蓝色菌落, 半乳糖苷酶 C端编码序列,转化,转化,图 15-9 利用 互补原理筛选重组子pUC18,蓝白斑筛选重组质粒,（二）免疫学方法 （三）核酸杂交法 （四）PCR技术 （五）酶切鉴定,硝酸纤维膜,复制培养,溶菌、中和 蛋白酶处理 漂洗、烘干,1、32P探针 2、放射自显影,鉴定克隆 （含感兴趣DNA）,图15-10原位杂交,硝酸纤维膜 菌落 琼脂培养板,PCR鉴定重组质粒,第四节 真核细胞转染,一、真核细胞转染的基本方法 （一）磷酸钙共沉淀法 （二）电穿孔法 （四）脂质体介导基因导入 （五）显微注射法 （六） CaCl2处理后转染,二、转染细胞的筛选 （一）tk- 细胞突变株筛选转染细胞 HAT选择法,tk- 细胞,tk+ 质粒,转染,tk+ 细胞,HAT培养基,生长,（二）筛选转染细胞 常用的抗性基因： 新霉素抗性基因（neor）,此基因对氨基糖苷抗生素G418有抗药性 潮霉素抗性基因 氨甲蝶呤抗性基因 氨基蝶呤抗性基因 霉酚酸抗性基因,第五节 克隆基因的表达,一、克隆基因在大肠杆菌中的表达 在大肠杆菌中表达外源基因，主要考虑的要素有： 1、目的基因 2、载体 3、目的基因与载体的连接 4、受体菌株和诱导条件,二、克隆基因在哺乳动物细胞中的表达 三、克隆基因在其它表达系统中的表达 （一）昆虫表达系统 （二）酵母表达系统,真核表达体系 如：酵母、昆虫、哺乳动物细胞表达系统 优点：能转录后加工，即能剪接内含子；能翻译后加工，即能糖基化修饰等；通常不形成包涵体，能正确折叠。 缺点：但技术难度较大，成本较高，表达量较低。,第九章 DNA序列测定 DNA sequencing,第一节 Sanger双脱 氧链终止法 Dideoxy chain termination,一、Sanger双脱氧链终止法原理 双脱氧终止法是由 Sanger于1977年建立的DNA序列测定方法，也称为引物合成法或酶促合成法。 原理,反应物： （1）待测DNA模板，可以是单链也可以是双链。,（2）DNA聚合酶 常用Klenow片段 催化特点：模板为DNA； 原料为dNTP； 存在引物的3-OH； 遵守碱基配对原则； 合成方向5 3； 校读作用。,（3）原料dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）。其中一种带32P或35S放射性标记。 （4）脱氧核苷酸链延伸的特异性终止剂2，3-双脱氧核苷三磷酸（2，3-dideoxynucleoside tripsphate,ddNTP）,N,H,H,P,P,P,O,O,O,O,O,OH,OH,OH,HO,2-脱氧核苷三磷酸（dNTP）,O,OH,H,H,H,OCH2,A、 G 、 C或T,N,H,H,P,P,32P,O,O,O,O,O,OH,OH,OH,HO,-32P- dNTP,O,OH,H,H,H,OCH2,A、 G 、 C或 T,N,H,H,P,P,P,O,O,35S,O,O,OH,OH,OH,HO,-35S-dNTP,O,OH,H,H,H,OCH2,A、 G 、 C或T,N,H,H,P,P,P,O,O,O,O,O,OH,OH,OH,HO,2，3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）,O,H,H,H,H,OCH2,A、 G 、 C或T,（5）引物一段寡核苷酸片段,反应过程： （1）引物的结合 引物（其5-末端带有标记）与模板DNA3端互补结合；,GATCCCTGAGTAGTCAC CTAG-OH,引物结合部位,引物,3,5,5,3,（2）模板链互补链的合成 在DNA聚合酶（或Klenow片段）的催化下，按碱基配对原则，逐个将dNTP加到引物的3-OH端，合成模板链的互补链；,3,5,GATCCCTGAGTAGTCAC CTAGGGACTCATC-OH,5,3,（3）脱氧核苷酸链延伸的终止 在实验中设4组反应体系，每一体系中加入4种 dNTP混合物和一种ddNTP。反应时，ddNTP和dNTP会竞争掺入新生 DNA链中，使DNA链延伸终止，并以ddNTP结尾。由于ddNTP比例较低，所以终止位点是随机的。经过适当的温育之后，将会合成不同长度的DNA片段。,在含ddATP 的反应管中，DNA片段均以ddATP结尾。同理，含ddGTP 、 ddCTP或ddTTP的反应管中，DNA片段分别以ddGTP、ddCTP或ddTTP结尾。,CTAGGGA,CTAGGGACTCA,CTAGGGACTCATCA,CTAGGGACTCATCAGTG,5,3,3,3,3,5,5,5,dATP、dGTP dCTP、dTTP ddATP,GATCCCTGAGTAGTCAC CTAG-OH,3,5,5,3,Klenow,（4）合成产物的电泳分离 将上述4个反应混合物平行加到同一变性聚丙烯酰胺凝胶的4个相邻的泳道上作电泳分离。分辨率可达1bp。 （5）放射性自显影。 （6）从胶片上，直接读出单链DNA的核苷酸顺序。,反应物 A G C T,模板DNA + + + + 引物 + + + + 4种dNTP + + + + ddNTP ddATP ddGTP ddCTP ddTTP Klenow + + + + Buffer、ion + + + + 反应过程及生成物：,设4组反应体系，组成如下：,CTAGGGA,CTAGGGACTCA,CTAGGGACTCATCA,CTAGGGACTCATCAGTG,5,3,3,3,3,5,5,5,dATP、dGTP dCTP、dTTP ddATP,GATCCCTGAGTAGTCAC CTAG-OH,3,5,5,3,A组,Klenow,A,A,A,CTAGGGA,3,CTAGGGACTCA,3,CTAGGGACTCATCA,CTAGGGACTCATCAGTG,marker,A,A组的电泳结果,CTAGG,CTAGGG,CTAGGGACTCATCAG,CTAGGGACTCATCAGTG,5,3,3,3,3,5,5,5,dATP、dGTP dCTP、dTTP ddGTP,GATCCCTGAGTAGTCAC CTAG