实验动物质量监测课件

2019/4/18,2,实验动物质量监测的意义,生物学实验研究的四个基本条件 Animal，Equipment，Information，Reagent ，简称AEIR四要素 这4个要素在整个实验研究中具有同等重要的地位，不能忽略或偏废。事实上，实验动物质量往往成为制约性要素，影响整个实验的质量和水平 实验动物质量监测是实验动物科学的重要内容，是确保实验动物质量的必要手段。,2019/4/18,3,1、实验工作人员的健康和生命的保证,常见的人畜共患病：流行性出血热、狂犬病、猴B病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、利什曼原虫等,2019/4/18,4,2、动物生产和繁殖的保证,动物一旦染上传染病，则种群难以净化，一些烈性传染病如鼠痘、兔病毒性出血症等可致动物全军覆没，造成巨大经济损失。,2019/4/18,5,3、实验结果准确性、规律性、重复性的保证,2019/4/18,6,实验动物质量监测主要包括以下几个方面： 遗传质量 微生物与寄生虫质量 饲料质量 环境质量监测。,2019/4/18,7,第一节 遗传质量监测,实验动物的遗传背景与反应特性，是影响实验结果的重要因素。 不同遗传背景与反应特性的实验动物，对同一刺激有时可引起不同质和量的反应。 为了保存实验动物品种品系特性。使实验动物使用者在动物实验中能得到正确的、可重复的科学数据，实验动物生产者在严格遵守品系繁育技术路线的同时，还必须努力做好实验动物遗传质量的严格监测，以防止实验动物遗传上的污染和变异。,2019/4/18,8,如： BALB/c对放射线比其他品系更为敏感。 C57BL/6肿瘤发生率低，A系高。 BALB/c和C3H小鼠对鼠伤寒沙门氏菌的敏感性存在显著差异 SHR为自发性高血压大鼠，心血管疾病发生率高,2019/4/18,9,一、群体管理,管理上人为的粗心最易引起遗传上的混杂，所以对育种群进行恰当的管理是保证遗传质量的最有效方法。 每一个实验动物育种机构都应当认真执行良好的育种制度，完善地保持育种记录，基础群应有系谱记录。要做到以上要求，最重要的因素就是要有训练有素、经验丰富的技术人员。,2019/4/18,10,二、免疫学标记监测,（一）皮肤移植法 这是目前最常用和最灵敏的检测亚系内或亚系间组织相容性基因差异的方法。在小鼠和大鼠中普遍采用的是尾部或背部皮肤移植法。皮肤移植法灵敏度高。易掌握，经济。不需昂贵设备，易对植皮成活情况进行观察和判断。能有效地测出新发生的、造成亚系变异的遗传混杂和突变。,2019/4/18,11,（二）混合淋巴细胞反应 混合淋巴细胞反应的原理为：异源动物或遗传上有差异个体的淋巴细胞混合培养一定时间后，这些细胞会增殖，甚至进一步裂解。此反应结果可在79天获得，定期地从群体中抽取足够量的动物进行监测能够维护实验动物的品质。,2019/4/18,12,（三）淋巴组织移植 用供体的均质淋巴器官，如骨髓、脾、淋巴结、胸腺或胚胎肝脏制备出单细胞悬液。然后将适量活细胞通过静脉或腹腔注射到受体动物体内，组织相容性由受体中存活者及脾增大者来确定，也可以用放射学方法。根据移植细胞的存活数测定。,2019/4/18,13,三、生化标记监测,通过多种形式的电泳和电聚集。可检定生化标记即同工酶或蛋白质，常用的电泳介质有乙酸纤维素膜、淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。每一种标记系统做特异性染色，最后将得到的带型与公布的生化遗传图式进行比较。如中华人民共和国国家标准GB；T14923-2001公布9种常用近交系大鼠生化位点标记基因(表5-2)。,2019/4/18,14,表5-2 常用近交系大鼠生化位点标记基因,2019/4/18,15,四、骨骼形态特征监测,常采用“下颌骨分析法”来鉴别和检测大小鼠的亚系变异。 将年龄、性别、体重相当的大鼠或小鼠处死后，分辨右下颌骨，加以标记，在直角坐标系上测量出多个形态特征参考点距离。 将所有测量的平均数作统计分析，利用判别函数确定下颌骨形状。如果测量值集中，则表明被测亚系间无显著的遗传变异。,2019/4/18,16,五、染色体带型监测,可以利用染色体分带技术，鉴别C带和Q带作为染色体标记，用来区分大、小鼠的近交系，在多数大、小鼠的近交系中，所有中期染色体都存在C带材料，同源染色体的C带区域大小相同；不同的近交系，C带材料大小不同，是品系特异的，是一种很有价值的检测亚系变异和混杂来源的方法。,2019/4/18,17,六、现代分子生物学技术,传统的遗传监测方法来源于过去研究者对哺乳动物进行遗传分析时采用的研究手段。随着分子生物学技术的发展，分子生物学技术有可能取代传统的遗传监测方法，其优点是多态性高，位点丰富，实验技术成熟，直接涉及生物的遗传基础，DNA样品容易保存和运输等等。,2019/4/18,18,1限制性片断长度多态(RFLP)技术 当动物基因组DNA被限制性内切酶消化时，酶能够识别双链DNA链上的特定核苷酸序列，并在每条DNA链上切割产生一个切口，使DNA裂解为片断。这些片断的长度在动物群体中存在变异，造成多态现象。通过DNA电泳和DNA探针分子杂交技术，即可观察到不同带型。,2019/4/18,19,例如：位于小鼠第2号染色体补体-5（complement-5）位点(He)的pC5探针，当用Hind消化小鼠DNA时，C3H品系将产生一条2.7kb的带型，而AKP品系将产生6.0kb和4.6kb两条带型。从而可以在He位点上区别这两个品系。目前所报道的RFLP位点已多达1098个，给遗传学研究带来许多便利条件。,2019/4/18,20,2简单序列长度多态(SSLP)技术 简单序列长度多态位点是动物基因内广泛存在的由l4个核苷酸组成的成串的重复序列，又称为微卫星(micro satellite)。估计这样的DNA结构在哺乳动物基因组内的数目多达5万10万个。在每个特定的位点上，重复序列的长度在不同品系中存在着差异。采用夹在这些序列两端的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)和电泳，就能观察到这些位点的差异，从而区分不同的品系。,2019/4/18,21,例如：小鼠第16条染色体的D16Mit4位点，其PCR产物的大小（bp）在常用近交系中分别如下：C57BL/6-132，DBA/2-123，A/J-147，C3H-123，BALB/c-149，AKR-126，CBA-132。SSLP测试技术比RFLP技术简便，多态性高，需要的DNA样品较少，引物容易获得，推广应用前景可观。,2019/4/18,22,3DNA指纹(finger printing)技术 上述两种DNA技术是针对单个DNA位点进行的测试。DNA指纹技术一次可同时测试多个位点，所以有一定的优势。DNA指纹技术经过电泳后可获得十几到几十条带，而这些带型在个体之间或品系之间有差异，如同人类的指纹在每个人都不同一样，因此而得名。通常有两种方法获得DNA指纹图。一是用限制性内切酶和小卫星探针技术获得的DNA指纹。二是用较短的随机扩增引物或小卫星引物，通过PCR而获得的DNA指纹。,2019/4/18,23,DNA指纹图谱有时在亚系或亚群之间有区别，所以对亚系的监测十分有用。但是DNA指纹的结果因为电泳带太多而不好辨认和比较。因此，也影响其在遗传监测和其他研究中的应用。目前所做的DNA指纹比上述两种DNA技术少，但随着研究的深入和方法的改进，将来一定会有所突破。,2019/4/18,24,4随机扩增多态（RAPD）技术 RAPD技术是20世纪90年代发展起来的一种简便、快捷的检测基因组DNA多态性的遗传标记技术。该项技术首先将动物目的基因组DNA提纯、酶切，用含10个碱基的随机引物，对DNA进行PCR扩增，经电泳，便可在多个位点上得到扩增产物。各种DNA多态分析方法，,2019/4/18,25,如：DNA指纹、限制性片段长度多态(RFLP)等，虽然可直接检测基因组的遗传变异，但都不同程度地存在操作复杂、需要特异性操作、需要事先知道动物基因组DNA序列等不足。而RAPD技术，由于引物可任意改变，有可能找到任何一个个体特异的RAPD标记，从而为实验动物的遗传检测和分析提供一个十分有效的工具。,2019/4/18,26,七、遗传性状监测结果的分析,当被检查的遗传性状与每个品系的遗传概貌图一致时，同时遗传管理资料清晰、可信，可以认为有关品系的繁育生产正在正确地进行，该品系的动物遗传质量合格；若与遗传概貌图不一致时，可以考虑以下原因：,2019/4/18,27,1遗传污染(genetic contamination) 这是最常见的遗传变异，往往是由于遗传学管理不善所致。这种情况如发现得早，在被检查的性状中至少可以观察到一个以上基因标记发生改变，出现杂合型，或与遗传概貌不符的其他表型；如果发现得较迟，一些杂合基因可随机地固定为单一的纯合型，但与原品系的遗传概貌不一致。出现上述情况均应淘汰原品系，更换来源清楚、质量合格的动物作为新种，重新进行品系的繁育。,2019/4/18,28,2. 遗传漂变(genetic drift) 遗传漂变是指一个品种或品系动物基因型在饲养的过程中可能发生随机的改变。这种改变多由于近交系动物部分杂合基因尚未纯合时即进行了分系，造成了亚系和支系的形成。监测时可以看到一个品系所有的动物在12个基因标记上与原品系的遗传概貌不符，但表型一致又均为纯合型。这种情况在经同系异体移植试验排除了遗传污染后需按照亚系和支系重新命名。,2019/4/18,29,3遗传突变(mutation) 遗传突变在哺乳类动物中的频率为10-5。在分析监测结果时，如果仅看到一只动物单个基因标记出现杂合型，应考虑有否发生遗传突变。为了证实此点，往往需要根据动物编号查询该只动物同窝兄妹或双亲的基因标记表型。如遗传突变发生在亲代，则同窝兄妹均应为杂合型或分离产生不同的表型。,2019/4/18,30,如果在同窝兄妹或双亲中该基因标记的表型与遗传概貌图一致，应考虑被测个体发生了遗传突变。在检查时如同时发现其他基因标记的表型与遗传概貌图不符，无论是杂合型还是纯合型均应考虑发生了遗传污染，应立即淘汰换种。遗传突变如无特殊保留价值，在剔除突变的个体后，整个品系可以继续保存；如有保存价值，可将突变个体单独培育成同源突变近交系。,2019/4/18,31,第二节 微生物学与寄生虫学监测,如何控制微生物和寄生虫，是实验动物标准化的主要内容之一。一般而言，科研中使用的实验动物，其微生物和寄生虫的控制级别越高，其结果就越精确、越可靠。,2019/4/18,32,一、监测意义,1对实验动物进行微生物、病毒与寄生虫的监控，对保证实验研究的顺利进行和工作人员的身体健康具有十分重要的意义。 实验动物被集中饲养，极易导致疾病的爆发与流行。实验动物疾病的爆发，除造成动物死亡外，还会干扰实验的顺利进行，引起生物制品的污染，对人类健康产生危害。,2019/4/18,33,2对实验动物饲养设施的监测，为确保这些设施能否控制微生物污染提供依据。 3对引进的实验动物进行检疫，避免病原体入侵原有的动物群。 4如动物群发生疾病，为了确证病原，对患病动物进行病原学诊断，积累对疾病的认识，收集菌株和毒株，进一步研究病原，为诊断试剂和疫苗的制备提供菌株和毒株。,2019/4/18,34,二、监测方法,（一）实验动物病毒学检测方法 1血清学检测 适用于各级各类实验动物的经常性检测和疫情普查。常用方法有：酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验(IFA)、免疫酶染色试验(IEA)、血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)、病毒中和试验、补体结合试验、琼脂扩散试验。,2019/4/18,35,2病原学检测 适用于动物群中有疾病流行，需要检出病毒或确认病毒存在的情况。检测方法有：病毒分离与鉴定，病毒颗粒、抗原或核酸的检出，潜在病毒的激活，抗体产生试验等。例如：采用HA或HI方法检查患病动物排泄物或组织悬液中的血凝素抗原；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检查病毒基因组；采用核酸分子杂交技术或聚合酶链反应(PCR)检出组织或排泄物中的病毒核酸。,2019/4/18,36,（二）实验动物细菌学检测方法 最常用的方法是病原菌的分离与培养或进行动物接种。部分病原菌，如：鼠伤寒沙门菌、鼠棒状杆菌、布氏杆菌、沙门菌、气管败血波氏杆菌等，可采取血清学方法，但仍需结合分离培养结果最后做出诊断。对于泰泽菌，由于不能在人工培养基上生长，因此宜采用组织压片、镜检的方法进行检查，并结合病理检查结果最后做出诊断。,2019/4/18,37,（三）实验动物真菌学检测方法 目前主要采用沙氏培养基分离培养。皮肤真菌一般在25培养，深部真菌在37培养。不同的真菌具有一定的菌落特点，镜下染色检查可进行种属鉴定，有时，还需借助于生物化学反应结果和免疫学方法进行最后诊断。,2019/4/18,38,（四）实验动物寄生虫学检测方法 1体外寄生虫 肉眼观察法、透明胶纸粘取法、拔毛取样法、皮屑刮取法、黑背景检查法、解剖镜下通体检查法等，主要检查蚤、虱、螨等节肢动物。,2019/4/18,39,2体内寄生虫 主要检查蠕虫和原虫，可用直接涂片法(粪便、血液、脏器、肠内容物)、饱和盐水漂浮法或沉淀法、透明胶纸肛门周围粘取法、组织或器官剖面压印法、病变组织切片或压片法、尿液的离心法(如查鼠膀胱线虫)等。 实验动物的微生物、寄生虫检测具体操作方法详见国家标准实验动物微生物学和寄生虫学的检测方法（啮齿类和兔类）（GB/T14926.1-14926.41-200 1）。,2019/4/18,40,三、监测要求,1选定监测项目 任何一种实验动物都有许多致病性微生物、寄生虫，结合具体情况选择合适的检测项目，既达到保证动物质量的目的，又可节省人力物力。我国经过十多年来对各地实验动物感染病原微生物、寄生虫情况的调查，结合其他国家的规定和经验，制定了我国啮齿类和兔类微生物学、寄生虫学等级标准，猫、犬、猴等中型实验动物，卫生部医学实验动物管理委员会亦有初步规定。,2019/4/18,41,2采样数量和频度 检测结果的准确性，要采取合适的动物数量。采样动物数可根据动物群体的污染程度而有所不同。 按照国家标准规定，动物数量超过100只的生产繁殖单元取样如下：普通级动物不能少于10只；清洁级动物检测510只；饲养于小隔离罩内的无菌动物和无特定病原体动物随机抽检2只；饲养于生产繁殖单元的抽检510只。,2019/4/18,42,除了采样的数量，还必须考虑到检测的间隔时间。一般来说，一旦病原体侵入动物群体引起感染，初期分离病原体较容易，抗体的检出率上升。23个月后可因某些个体抗体水平的降低以及新出生的非感染个体的增加等原因，抗体检出率下降，据此，检测间隔时间以3个月一次为宜。至少每年检查2次，选在春、秋季疾病多发季节为宜。,2019/4/18,43,采样时，宜在动物群中不同方位随机采取育成动物，选择至少4个不同的位置采集样品或采用前哨动物放人群内，不时调换位置，饲养一定时间后解剖检查抗体或病原。 运输途中保证动物的安全和避免污染。引种的动物则需有检疫隔离期，小鼠、大鼠和豚鼠l7天，兔21天，犬、猫2128天，猴l9周。,2019/4/18,44,第三节 饲料质量监控,实验动物作为生物体离不开营养，饲料是实验动物摄人营养素的主要来源。只有良好的营养才能使实验动物保持良好的健康状态，而健康的实验动物才能确保实验结果的可靠。因此，加强饲料质量标准化管理，是实现实验动物标准化的重要环节。,2019/4/18,45,一、实验动物饲料 生产加工、储存与管理,实验动物饲料是以实验动物饲养标准为依据，经过严密设计、科学配方、精心加工、生产制造而形成的标准化产品。因此，进行实验动物饲料生产必须了解有关实验动物饲养管理法规条例，全面掌握饲料的生产过程。,2019/4/18,46,1实验动物配合饲料的生产加工 应根据各种实验动物的特性和不同的实验目的，采用不同的饲料加工方法。常用实验动物如大鼠、小鼠、豚鼠及兔等实验动物的饲料应制成具有一定硬度的颗粒饲料较为适合其摄食习性；狗、猫则以膨化饲料为好；而有的实验动物根据实验目的不同，常要求制作糊状、粉状或液体饲料以满足研究需要。但是无论其形状如何，在实验动物饲料加工生产过程中都应注意生产规格及其产品标准。,2019/4/18,47,2实验动物饲料的储存 包括原料储存和成品储存两部分内容。 原料储存：应按原料种类、生产厂家、进货日期等分开保管。保管中要注意温度、湿度变化，防止鸟类、鼠类和昆虫的污染。尽量做到先进先出。 成品储存：要定期清扫存储罐，产品变更时彻底清扫存储罐，成品库内严格执行先进先出原则。注意存储罐的温、湿度，防止成品饲料霉变，防止野鼠、昆虫及有毒物质自引污染。分类堆放，标志清楚，严防与原料混贮，保证标准货物出库登记。,2019/4/18,48,3实验动物的饲料管理 实验动物饲料管理是指从饲料原料选择、生产加工到成品以及生产过程中的虫害、安全及卫生管理的全过程。,2019/4/18,49,二、实验动物饲料的消毒,实验动物的饲料在收获、加工、储存及运输过程中都有污染病菌的可能，为确保实验动物质量和动物实验的准确性，我们要通过适当的消毒方法使其达到灭菌的目的。常用饲料消毒方法有干热、湿热、辐照及药物熏蒸等多种，应按饲养动物的不同要求和饲料种类以及所具备的条件来选择。,2019/4/18,50,1干热灭菌法 将饲料在80100的条件下烘烤。此法设备比较简单，但温度不好掌握，灭菌不够彻底，而且营养损失较大。,2019/4/18,51,2高温高压灭菌法 高温高压灭菌法是指将饲料在121，1.0kg/cm3的高温高压蒸锅内加热15min以上，将细菌全部杀死。一般11530min、12l20min、12515min。绝大多数维生素。尤其是维生素C、维生素B1、维生素B6和维生素A等，过热会受到破坏，而纯化学性饲料比天然饲料更不稳定。,2019/4/18,52,3药物熏蒸灭菌法 熏蒸是利用化学药品的气雾剂对饲料进行消毒。如用环氧乙烷进行灭菌，熏蒸后必须在不低于20的自然空气中将残余气体挥发。实验证明，即使这样处理，在饲料中仍然残存一些对动物代谢有损害的化合物。,2019/4/18,53,4. 放射线照射灭菌法 通常在对谷物类饲料消毒时，采用5Mrad剂量的60Co照射对营养成分损失甚小。射线对维生素B1和维生素B6仅有微小破坏，通常采用的剂量为35Mrad。此法在灭菌效果和对营养素的破坏程度方面都优于其他方法。但受条件所限，不便推广。,2019/4/18,54,三、实验动物饲料的检测,饲料检测是实验动物饲料质量管理必不可少的重要手段。饲料质量变化不仅直接影响着实验动物质量，而且也间接影响实验结果的可靠性。我国实验动物饲料质量应符合国家标准GBl4924-2001规定的根据实验动物的不同种类、性别、年龄、体重和生理阶段制定的饲养标准。,2019/4/18,55,1感观性状的检验 用手、眼、鼻等器官直接通过色泽、气味、手感、杂质情况等项指标对饲料的新鲜程度、均匀度、含水量等进行直观判断。 2营养成分的测定 按照国家实验动物饲料营养标准所规定的养分含量及分析方法，对产品的营养成分和混合均匀度等进行检测。,52,2019/4/18,56,第四节 环境质量监测,严格监控实验动物生产环境和动物实验环境，可保证实验动物健康和质量标准化，可保障实验研究获得正确的结果。合乎标准的环境，不仅为实验动物及动物实验工作者提供适宜的条件，维持实验动物等级标准，而且是保障工作人员身体健康，使他们不受危害因素伤害的需要。,2019/4/18,57,一、噪声测定,1仪器 普通噪声计、积分型噪声计。 2测定方法 分静态和动态：静态为在动物饲养前，所有系统正常运转时检测；动态为饲养动物后，在正常饲养条件下检测。 通常在洁净室无人、无动物，空调净化系统正常运行的情况下测定洁净室的噪声，测定点选择在被测环境的中央，如房间大于15m2，可选择两个或两个以上的测定点，距地面1m。,2019/4/18,58,二、照度测定,1仪器 便携式照度计。 2测定方法 测定者需穿着黑色衣服，避免反射光影响测定结果。测定前开启所有的照明设备，测定时以距墙壁1m以上、离地面85cm处的平面照明度为准。每隔1.02.0m选择一个测量点，每点测3次，取平均值，单位为lx。,2019/4/18,59,三、空气落下细菌测定,空气落下菌数测定应在实验动物设施经消毒灭菌，空调净化系统正常运行48h后进行。1试剂 直径9cm的血液琼脂培养基。 2测定方法 在无动物的状态下，每510m2放置一个直径9cm的血液琼脂培养基，敞开皿盖暴露30min，盖上皿盖，置于37培养4872h后，计算培养皿内菌落数。,2019/4/18,60,四、空气洁净度测定,在动物饲养前，空调净化系统运行48h后进行。 1、检测仪器 尘埃粒子计数器。 2、方法 乱流洁净室面积不大于50m2的布置5个测点，每增加2050m2应增加35个测点。每个测定点连续测定3次。测定时100级净化室的采样量每分钟不少于1L，1000级以上的净化室的采样量每分钟不小于0.3L。层流洁净室取各测定点最大值；乱流洁净室取洁净室各测点的平均值作为实测结果。,2019/4/18,61,五、相邻洁净区静压差测定,1仪器 微压计，最小刻度为1.0Pa。 2测定方法 测定顺序一般由低压到高压，测定前将需要测定压差的两个区域封闭，关闭所有的门。测定时将测定用的胶管穿过墙上或门上预留的孔洞进入室内(穿胶管的孔洞必