植物细胞工程的原理、方法和应用.docx

植物细胞工程原理、方法和应用一植物细胞工程的原理及方法 植物细胞具有全能性，即具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。而让细胞发挥出全能性的方法，就是细胞脱分化。细胞脱分化，就是让已经分化的细胞，经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成为未分化细胞，进而形成愈伤组织。愈伤组织在一定的培养条件下，分化出幼根和芽，进而形成完整小植株，这就是愈伤组织再分化。归结起来，植物细胞工程的主要原理是植物细胞的全能性，以及单倍体育种、植物的低温储藏等。现在我们就来着重谈一谈植物细胞全能性，一个植物体的全部细胞，都是从受精卵经过有丝分裂产生的。受精卵是一个特异性的细胞，它具有本种植物所特有的全部遗传信息。因此，植物体内的每一个体细胞也都具有和受精卵完全一样的DNA序链和相同的细胞质环境。当这些细胞在植物体内的时候，由于受到所在器官和组织环境的束缚，仅仅表现一定的形态和局部的功能。可是它们的遗传潜力并没有丧失，全部遗传信息仍然被保持在DNA的序链之中，一旦脱离了原来器官组织的束缚，成为游离状态，在一定的营养条件和植物激素的诱导下，细胞的全能性就能表现出来。于是就象一个受精卵那样，由单个细胞形成愈伤组织然后成为胚状体，再进而长成一棵完整的植株。所以离体培养之所以能够成功，首先是由于植物细胞具有全能性的缘故。一.植物组织培养技术 植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在无菌条件下接种在含有各种营养物质及植物激素的培养基上进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。 其中，培养技术又分为：胚胎培养、器官培养、组织培养、细胞培养和原生质体培养。1、胚胎培养：指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。植物胚胎培养又分为1胚培养、幼胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养、植物离体受精，是对不同的胚进行人工离体无菌培养。意义：1,克服杂种胚的败育,获得稀有杂种2,获得单倍体和多倍体植株3,打破种子休眠,促进胚萌发4,快速繁殖良种,缩短育种周期5,克服种子生活力低下和自然不育性,提高种子发芽率6,提高后代抗性,改良品质7,种子活力的快速测定8,种质资源的搜集和保存9,研究胚胎发育的过程和控制机制2.组织培养指以分离出植物各部位的组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的植物组织培养。方法：1、非试管微组织快繁非试管微组织快繁技术是将外植体（一般要求带一叶一芽）放置在室内外普通沙子培养基上进行培养，利用植物腋芽自然倍增达到快速繁殖的目的。一般植物715天可以生长出根系。此技术投资低，操作环节少。2、试管组织培养试管组织培养是将外植体（即离体组织、器官或细胞）放置在组培瓶等器皿中在无菌的条件下进行组织培养获得组培瓶苗。优点：1、占用空间小，不受地区、季节限制。2、培养脱毒作物3、培养周期短4、可用组培中的愈伤组织制取特殊的生化制品5、可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物6、可诱导之分化成需要的器官，如根和芽7、解决有些植物产种子少或无的难题，8、不存在变异，可保持原母本的一切遗传特征9、投资少，经济效益高10、繁殖方式多，试用品种多3、器官培养指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，茎的茎尖、茎节和切段，叶的叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶，花器的花瓣、雄蕊（花药、花丝）、胚珠、子房、果实等的离体无菌培养。一般与组织培养没有大的差别，但对含有叶绿素的器官，要在光下进行单独营养，因此能在简单的只含无机盐的培养基中即可发育。但是在暗培养条件下，如果不供给呼吸基质和维生素类以及其它有机物则不能生长。植物的培养组织，比动物器官的形成能力要大得多。许多组织培养，培养时间长了，便过渡到器官培养，因此这里不易严格区分，可把两者总括起来称为广义的组织培养。4、单细胞培养植物细胞培养是在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行震荡培养，得到分散成游离 的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。依据的原理是植物细胞的全能性。而植物单细胞培养则在此基础上，提供了进一步筛选的可能性。因为在植物的体细胞中，并不是每个细胞的生命状态以及活性都是相同的。我们可以选出具有优良性状的体细胞进行单细胞培养，获得更佳的植株。5、原生质体培养。指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。主要有液体浅层培养法、液体悬滴培养、固体平板法、固液双层培养法（应用最广泛）、琼脂糖珠培养法。特征：无细胞壁障碍，可以方便地进行有关遗传操作，并可以对膜，细胞器等进行基础研究。具有全能性，并能进行人工培养发育成完整植株。原生质体适合进行诱导融合形成杂种细胞。意义：植物原生质体是细胞无性系变异和突变体筛选的重要来源；植物原生质体是细胞融合工作的基础；植物原生质体是植物遗传工程的理想受体和遗传饰变的理想材料；在细胞生物学与遗传理论研究上的应用。二人工诱发单倍体单倍体育种，同样是基于植物组织培养技术，利用植物组织培养技术（如花药离体培养等）诱导产生单倍体植株，再通过某种手段使染色体组加倍（如用秋水仙素处理），从而使植物恢复正常染色体数。单倍体是具有体细胞染色体数为本物种配子染色体数的生物个体。方法：花药离体培养；秋水仙素处理使染色体加倍意义：单倍体植株经染色体加倍后，在一个世代中即可出现纯合的二倍体(一般情况下为纯合，但在亲本为多倍体情况下，得到的单倍体植株加倍后，子代可能为杂合。)1，从中选出的优良纯合系后代不分离，表现整齐一致,可缩短育种年限。单倍体植株中由隐性基因控制的性状，虽经染色体加倍,但由于没有显性基因的掩盖而容易显现。这对诱变育种和突变遗传研究很有好处。在诱导频率较高时，单倍体能在植株上较充分地显现重组的配子类型，可提供新的遗传资源和选择材料。中国首先应用单倍体育种法改良作物品种，已育成了一些烟草、水稻、小麦等优良品种。单倍体育种如能进一步提高诱导频率并与杂交育种、诱变育种、远缘杂交等相结合应用，则在作物品种改良上的作用将更显著。三细胞融合植物细胞融合是指人工的方法用纤维酶、果胶酶等酶作用于植物组织，并将获得的原生质体通过聚乙二醇等诱导融合剂使相邻原生质体融合在一起。然后, 经过原生质体培养、细胞壁再生、愈伤组织形成, 最后培育成再生植物。同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。优点：细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体。单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。四超低温冷冻保存种子超低温冷冻保存种子，是将植物的细胞或组织经过防冻处理后，在-80C以下保存的方法。原理： 极端低温温度下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止。因此，细胞、组织和器官在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变，也不会丢失形态发生的潜能。同时，由于超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，因此可以长期保存植物材料。意义：1.防止资源灭绝、节约人力物力、便于交流。2.可以在有限空间内保存大量资源。3.与种子保存相比，可以不受时间和高含水量的限制。4.与试管苗相比，可以避免频繁继代而带来的变异。贰植物细胞工程的应用一、胚胎培养技术的应用植物胚胎培养是胚、胚珠、子房和胚乳的离体培养技术, 其应用领域包括胚胎的发育机理、克服杂交不亲合性和胚拯救、克服珠心胚的干扰、打破种子休眠, 缩短育种周期, 获得体细胞胚和人工种子, 建立植物高效再生体系等, 并在农作物、园艺作物、林木和药用植物上广泛应用。植物离体受精可通过离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉、离体精细胞和卵细胞融合等方法实现。该技术可以克服植物授粉不亲和的问题, 同时也可以进行胚胎、种子和果实发育机理等基础研究。人工分离的精细胞和卵细胞融合后进行合子胚培养, 已在玉米等植物上获得成功 13 。植物离体受精技术是植物细胞工程中的重要实验技术, 为研究植物胚胎发育机理提供了新的实验系统, 为开发新的植物转基因途径提供了可能二、微型繁殖即使用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，也叫快速繁殖技术。该技术可以保持优良品种的遗传特性，且具有周期短，不受季节、气候、自然灾害等因素影响等优点。以此它能够快速的实现种苗的大量繁殖。三、人工种子农业生产中使用的天然种子，一般都是由种皮、胚乳和胚三部分构成。种皮通常在种子的外层起保护作用；胚乳含有大量的营养物质，是种苗萌发生长不可缺少的营养来源；胚由胚芽、胚轴、胚根和子叶构成，将来发成植株。农业生物技术的发展，通过组织培养技术，可把植物组织的细胞培养成在形态及生理上与天然种子胚相似的胚状体，也叫作体细胞胚。这种体细胞胚有于叶、根、茎分生组织的结构。科学家把体细胞胚包埋在胶囊内形成球状结构，使其具备种子机能。所以，人工种子是一种人工制造的代替天然种子的颗粒体，可以直接播种于田间。意义：1.在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效应；2.可以对优异杂种不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有主要的适用意义；3.对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用；4.与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险；5.与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。四、作物脱毒就植物脱毒而言，基本分为有性脱毒，无性脱毒两种。有性脱毒就是种子。无性脱毒，一般为组织培养。一般来说，为了改善植物的性状，长期的无性繁殖再植物细胞内积累了大量的有毒物质，从而对植物的寿命，性状，产量等产生一定的影响。往往植物还容易的一些病害。所以，无性生殖的植物，需要经常脱毒。以加强植物的性状，防治一些病害通常利用组织培养，去植物的茎尖部分进行细胞培养，用培养出的病毒浓度较低的植株，在去其茎尖，进一步培养。这样反复几次之后，病毒的浓度逐渐降低，最后得到基本无毒的植物。五、突变体的利用即使对植物组织培养过程中的愈伤组织进行诱变处理，初期发生突变，诱导分化成植株，筛选对人们有利的突变体，进而培育新品种。六加倍单倍体技术及其应用加倍单倍体技术是指利用植物组织培养技术培养单倍体植物材料 获得单倍体植物, 然后通过自然或人工加倍的方法获得双倍体植株的技术, 其中以花药和花粉培养应用最为广泛。 雌核发育( Gynogenesis) 是植物存在的自然现象,在离体条件下可以通过培养未受精的子房和胚珠产生单倍体植株, 也可以在活体条件下通过授以不同种类的花粉或通过物理方法处理( 如辐照处理) 的花粉, 诱导雌核发育 15 , 目前已在小麦、水稻、玉米、甜菜、向日葵、马铃薯、西葫芦、洋葱、黄瓜、非洲菊、百合、小黑杨、三叶橡胶、烟草、矮牵牛等10 多种植物上获得成功。离体条件下诱导孤雌生殖获得加倍单倍体的技术发展时间不长, 现已开始应用于作物的改良、构建遗传分析和转基因的受体材料。【1】 韩佳寅； 梁爱华。全胚胎培养技术及其应用研究进展。中国中药杂志。2010（05）【2】 李杰;黄敏仁;王明庥;蔡汝。植物原生质体培养与融合的研究进展。海南师范学院学报(自然科学版)。2005-09-30【3】 陈钦耀。植物细胞融合技术的研究概况。生物学杂志。1984（03）【4】 汪勋清； 刘录祥。植物细胞工程研究应用与展望。核农学报.2008（05）【5】 陈庆华。突变体的选择和利用(二)。辽宁农业科学。1982（05）【6】 丁绍欢； 张明生； 史梦娜。植物人工种子技术研究进展。种子, Seed。2011（03）7霍乃蕊； 韩克光。细胞融合技术的发展及应用、激光生物学报。2006（02）8 刘巧泉；周丽慧；王红梅；顾铭洪. 水稻种子贮藏蛋白合成的分子生物学研究进展分子植物育种.2008(01)【9】张圣仓；魏安智；杨途熙. 果树单倍体和加倍单倍体(DH)技术研究与应用进展. 果树学报.2011(05)10 黄静；赵琦；赵玉锦等. 植物细胞电融合技术在空间实验中的应用. 生物技术通报.2007(01)【11】曾洪学；张小华. 植物细胞全能性理论在中国的研究与实践.分子植物育种.2004(06)12 孙忠青. 植物细胞的全能性及应用. 安徽农业科学.2013(21)13 WU Bo-JI CHEN YI-PING CUI YA-YA. STUDY ON WAYS OF FORCING INTERCELLULAR CYTOPLASM AND CHROMATIN MIGRATION TO TRANSFER EXTERNAL GENETIC SUB