课件：第章微生物菌种的筛选及鉴定.ppt

主 讲 惠 明 博士,现代食品微生物学,第8章 食品微生物菌种的筛选及鉴定,2019,-,1,本节要点,食品工业上典型的微生物菌种 微生物菌种的分离筛选及鉴定 微生物菌种的发酵条件优化,2019,-,2,一、典型工业微生物菌种,细菌：枯草杆菌，短杆菌，大肠杆菌 酵母：酿酒酵母（啤酒，葡萄酒），酒精酵母，假丝酵母 霉菌：黑曲霉，土曲霉，米曲霉，红曲霉，根霉，木霉，青霉 放线菌：单孢菌 其他：藻类,2019,-,3,发酵工业常见常用的细菌,Leuconostoc mesenteroides 肠膜明串珠菌 Pediococcus cerevisiae 啤酒足细菌 Bacillus subtilis 枯草芽孢杆菌 Acetobacter aceti 醋化醋杆菌 Lactobacillus delbrukii 德氏乳杆菌 Steptococcus lactis 乳链球菌 Clostridium acetobutylcum 丙酮丁醇梭菌 Corynebacterum pekinese 北京棒杆菌 Brevibacterium ammoniagenes 产氨短杆菌,2019,-,4,常见工业微生物及其产物,细菌 短杆菌：谷氨酸、肌苷酸 枯草芽孢杆菌：淀粉酶、蛋白酶、核糖 大肠杆菌：酰胺酶 节杆菌：强的松 梭状杆菌：丙酮、丁醇,2019,-,5,工业上常用的放线菌及产物,链霉菌属 Streptomyces 生产抗生素、维生素、酶及酶抑制剂 诺卡氏菌属 Nocardia 生产抗生素，石油脱蜡、烃类发酵， 处理含氰废水 小单孢菌属 Micromonospora 庆大霉素，Rifamycin 孢囊链霉菌属 Streptosporanium 多霉素,6,2019,-,酵母 酒精酵母：乙醇 甘油酵母：甘油 假丝酵母：环烷酸、SCP 啤酒酵母：细胞色素、辅酶、酵母片 类酵母：脂肪酶 阿氏假囊酵母：核黄素 脆壁酵母：乳糖酶,常见工业微生物及其产物,2019,-,7,霉菌 黑曲霉：柠檬酸、蛋白酶、单宁酶、 糖化酶 栖土曲霉：蛋白酶 根霉：糖化酶、甾体激素、 青霉：青霉素、葡萄糖氧化酶 木霉：纤维素酶 红曲霉：糖化霉、红曲色素,常见工业微生物及其产物,霉菌分生孢子,2019,-,8,Saccharomyces cerevisiae,BEER,Bacillus subtilis B53,NATTO,2019,-,9,工业上对生产菌种的基本要求 从自然界中分离目的菌种的原则 菌种选育的一般方法,二、食品工业微生物菌种的来源,2019,-,10,2.1 对工业微生物菌种的基本要求,能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造可操作性要强 遗传性能要相对稳定 不易感染杂菌或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关） 生产特性要符合工艺要求,11,2019,-,2.2 从自然界中分离筛选菌种,生产菌株来源 1、索取或购买 2、自己选育 用原有菌株进行遗传改造进行育种 诱变育种/基因重组育种 向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育 从自然界中分离菌种 从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。,2019,-,12,设计方案采样增殖培养*平板分离 筛选（初筛、复筛）单株纯种分离 性能考察（生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）,从自然界中分离筛选菌种的一般步骤,2.2.1采样 从自然界种采集含目的菌的样品,2019,-,13,1. 环境条件对土样本中微生物分布的影响 （1） 营养环境 高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土壤中：耐渗透压酵母，柠檬酸产生菌，氨基酸产生菌； 富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉酶产生菌； 森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌； 含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中：蛋白酶产生菌； 油田土：石油分解菌 ；,2019,-,14,（2） 水分 取离地表5-15cm的土样 含水过多、过少都不理想 （3） 温度：采样以秋季为好 （4） 通风 （5）酸碱度： 细菌、放线菌：中性或偏碱； 霉菌、酵母：偏酸,2019,-,15,2. 采样方法 （1） 去除表层土 （2） 取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中 3. 注意 记录：时间，地点，环境情况等 样品袋应封好口，防止水分失去 土样应在分离前破碎 尽快分离,2019,-,16,2.2.2增殖培养（富集培养）,适用：样品中目的菌数量不够多时 目的：提高样品中目的菌的数量和比例 原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制,2019,-,17,1、 方法 （1） 控制营养成分 纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌 可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种 酒精废水，可以增殖废水利用菌 * 多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素 （2） 控制培养基pH 细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸 但非目的菌的生长不能被完全抑制,2019,-,18,（3）控制培养温度 30左右培养，可培殖嗜温微生物 5060培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株 （4）热处理增殖芽孢细菌 样品悬浮液经80、10min处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌,2019,-,19,（5）添加抑制剂 10%苯酚数滴：抑制细菌、霉菌生长，增殖放线菌 多粘菌素B：抑制G-细菌 青霉素：抑制G+细菌 制霉菌素：抑制真菌 放线菌酮：抑制真菌,2019,-,20,21,2019,-,2.2.3纯种分离,目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养 1 纯种分离的一般方法 稀释平板法 倾注平板或涂布平板 划线法,2019,-,22,稀释分离涂布平板,2019,-,23,稀释分离倾注平板,2019,-,24,划线分离,2019,-,25,（3）组织培养法 适用于分离高等真菌及植物病原菌 高等真菌：如香菇切1小块菌盖10%漂白粉消毒处理无菌水冲洗置琼脂平板上培养长出菌丝体 注意：对蔓延性霉菌： 加1%去氧胆酸钠 察氏培养基：0.01%蔗糖， 0.1%山梨糖,2019,-,26,2、平皿反应快速检出法定性或半定量 （1）纸片培养显色法 滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基 用接种环接种 保湿恒温培养 据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量 （2）透明圈法 根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产物的产量 淀粉平板透明圈：淀粉酶 碳酸钙平板透明圈：产酸 酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶,2019,-,27,以大肠杆菌E. coli ATCC 80739为指示菌，对枯草芽孢杆菌R21-4进行紫外诱变，筛选得到一株具有良好遗传稳定性的枯草芽孢杆菌R21-15，抗菌蛋白的效价提高58.49%。,2019,-,28,粗提蛋白对棉花黄、枯萎病菌的抑制作用,2019,-,29,（3）变色圈法 淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶 支链淀粉平板喷稀碘液： 蓝色圈：异淀粉酶 无色圈：液化型淀粉酶 葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶 木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶,2019,-,30,（4）生长圈法 工具菌： 营养缺陷型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积累的产物 菌落形态明显不同于目的菌 方法：106107 工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌 适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育,2019,-,31,（5）抑制圈 适用：抗生素产生菌的选育 工具菌：对目的抗生素敏感的微生物 例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株 工具菌可使用金黄色葡萄球菌 方法 目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落 代谢物积累：用打孔器（6MM）将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5d，使新产生抗生素积累于小琼脂块中 测定：取107工具菌涂布于琼脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低,2019,-,32,琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序,2019,-,33,（6）菌落特征,从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,2019,-,34,（7）从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素 产物分子的结构定性分析（利用紫外扫描光谱、核磁共振、CD谱、高压液相色谱、远红外分析、X-射线衍射分析、穆斯堡尔谱等） 产物的定量分析,35,2019,-,3、厌氧性微生物的分离法 （1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh（氧化还原电位） 煮沸法：将培养基置沸水中煮沸15分钟，驱除其中的溶解氧，勿再摇动，Eh可降至0.1V 以下 培养基预还原：将培养基中加入还原性物质：半胱氨酸，巯基化生物，Na2S，抗坏血酸等降低Eh,2019,-,36,（2）创造无氧环境 物理除氧 空气置换法：干燥器或厌氧培养罐 抽真空 76mmHg充入N2 （反复3次）充入CO2 10% +H2 10% + N2 80% 化学除氧 H2 + O2 H2O (钯作催化剂） GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反应产生H2 和CO2，H2与O2反应生成水 厌氧指示剂,2019,-,37,（3）厌氧分离（培养）技术 高层琼脂柱技术 厌氧罐技术 厌氧手套箱技术,厌氧手套箱,2019,-,38,厌氧培养装置,2019,-,39,2019,-,40,2.2.4 筛选 1、初筛：通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行，每株一瓶 目的：淘汰80%-90%的分离菌株中的低产菌 （1）培养条件：主要通过查阅资料及需要而预先决定：如培养基组成，通风量（装液量，摇瓶机转数），pH、温度、培养时间等。 （2）分析测定：最好定量，如较困难时可采取半定量方法,2019,-,41,2、复筛：每株35瓶，可提前培养种子，使接种量比较一致，35%接种量， 培养条件可同初筛 分析测定：定量，注意副产物 复筛可进行多次，逐步淘汰，留下35株甚至最好的1株,2019,-,42,初筛和复筛的比较,2019,-,43,好氧培养,2019,-,44,2.2.5 复筛高产菌株的分类鉴定,菌体形态特征分析 菌体大小、排列、运动性、产芽孢（孢子）特征、产荚膜？鞭毛、菌丝分枝？染色特征 生理生化特征分析 碳源、氮源、无机盐、生长因子、产酶反应、药物敏感性 遗传特征鉴定 1、G+C（mol%)（差异5%可以认为不同种，10%可以认为不同属, 2、 16s rRNA的基因序列（同源性97%认为同种）,45,2019,-,举例：产PGA芽孢杆菌的鉴定,细胞形态特征 菌体大小 芽孢形状 芽孢着生位置 G+或G-等,46,2019,-,生理生化特征,47,2019,-,2019,-,48,2019,-,49,2.2.6 培养工艺条件试验与生产试验,1、摇瓶发酵条件 培养基组成，初始pH，通风量（装液量），接种量，培养温度 2、小型台式发酵罐发酵工艺条件 溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡剂,50,2019,-,培养基配方的获得,单因素试验 多因素试验（正交试验） 回归试验 最佳配方的验证 整个发酵条件的优化,51,2019,-,举例 碳氮源对Bacillus subtilis发酵产PGA的影响,基本发酵培养基：L-Glu 20g/L，CTA 10g/L，NH4Cl 4g/L，MgSO47H2O 0.5g/L，FeCl36H2O 0.02g/L，K2HPO4 1g/L，CaCl22H2O 0.2g/L，MnSO4H2O 0.05g/L, 蒸馏水配制，用NaOH调pH7.4，0.1MPa灭菌20min。 基本发酵条件:采用300mL三角瓶，装液量50mL，无菌培养容器封口膜封口，摇瓶转速150rpm，种子液种龄24h，接种量4%，37振荡培养96h。,2019,-,52,初步确定可能的培养基成分(以碳源为例),2019,-,53,2019,-,54,2019,-,55,2019,-,56,2019,-,57,2019,-,58,枯草芽孢杆菌合成-PGA培养基优化的回归试验设计,对甘油及柠檬酸添加量的优化(正交组合设计) 选择因素:Z1甘油（g/L）,40120; Z2柠檬酸（g/L）,420 其它发酵条件为：Glu 20g/L，(NH4)2SO4 7g/L，K2HPO43H2O 0.7g/L，MgSO47H2O 0.5g/L，FeCl36H2O 0.02g/L，CaCl2 0.25g/L，MnSO4H2O 0.3g/L，pH6.5，装液量50mL/300mL三角瓶，接种量4%(培养24h种子液)，摇瓶转速150r/min。 取三水平，Z1：40，80，120; Z2：4，12，20。作变换：X1=（Z1-80）/40， X2=（Z2-12）/8 试验方案及试验结果的分析下表,2019,-,59,2019,-,60,2019,-,61,2019,-,62,综合对碳源、氮源及无机离子的优化试验，得到优化发酵培养基（二）： L-Glu 20g/L，CTA 9.864g/L，Glycerol 80.36g/L，(NH4)2SO4 7g/L，MgSO47H2O 0.5g/L，FeCl36H2O 0.0224g/L，K2HPO4 0.8922g/L，CaCl2 0.0323g/L， MnSO4H2O 0.3g/L, 蒸馏水配置，用NaOH调pH6.5，0.1MPa灭菌20min。 基本发酵条件：采用300mL三角瓶装液量50mL，种子液24h，接种量4%（v/v）,摇瓶转速150r/min，37振荡培养96h。,2019,-,63,2019,-,64,摇瓶水平到反应器水平的优化配方,2019,-,65,2019,-,66,pH控制摇床：反应器水平上的摇瓶研究,2019,-,67,发酵罐：反应器水平, 可以得出最 终优化的基 础配方,2019,-,68,小结：微生物菌种的发掘程序,微生物资源的全程开发大体要有：设计、收集样品、分离菌种、筛选、小试、中试、产业化等阶段。 即 方案采样筛选（初选复选终选） 实验室实验中试生产产业化,69,2019,-,总设计(开发目的、策略、工作基础