课件：技术.ppt

生化实验第四小组,聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction，PCR）,目录,PCR反应的基本过程,PCR的应用,PCR反应程序的优化,PCR的优点,PCR的定义,PCR的临床应用,PCR技术,广泛用于分子生物学和基因工程及其它与DNA鉴定相关的领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。,PCR技术即聚合酶链式反应技术，是1986年由Kallis Mullis发现的。 通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。,1971年，Khorana等人就提出了利用PCR在体外扩增DNA的概念； Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因； 1988年，Chien从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离出耐热DNA聚合酶，简称Taq DNA聚合酶； Mullis正式确定了体外扩增DNA技术，1987年获得专利，命名为Polymerase Chain Reaction (PCR)。,PCR技术产生的历史背景,PCR反应的基本过程,PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR反应体系的基本成分,10PCR Buffer MgCl2或MgSO4 dNTP Mixture (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 引物 (随机引物或特异引物) 模板DNA Taq DNA polymerase ddH2O,PCR引物设计的基本原则,合理的设计可在扩增的特异性和有效性之间找到一个平衡点。 1 引物长度通常1830bp； 2 解链温度(Tm); Tm=4(G+C)+2(A+T) 3 GC含量以40%60%为宜，GC太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带； 4 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列； 5 避免引物内部出现二级结构，以及避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带； 6 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； 7 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处； 8 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。,dNTPs,dNTP的质量、浓度与PCR扩增效率有密切关系， dNTP溶液的pH为7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。反复冻融会使dNTP降解。 在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的摩尔浓度要相等，如果其中任何一种浓度不同，就会引起错配。 dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低,Mg2+浓度,Mg2+是激活DNA polymerase的活性中心。 Mg2+对PCR的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度以1.52.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,PCR反应程序优化的基本原则,1 温度与时间的设置 在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA聚合酶的作用下，引物链沿模板延伸。 较短靶序列(长度为100300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外，退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸。 变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394 l min足以使模板DNA变性，但温度过高对酶的活性有影响。此步若不能使模板DNA完全变性，就会导致PCR失败。 退火温度与时间 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度： Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T) 复性温度=Tm值-(510),2019/4/19,11,可编辑,PCR反应程序优化的基本原则,延伸温度与时间 PCR反应的延伸温度常用72。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定： 1 kb的靶序列 延伸时间1min； 34kb的靶序列 延伸时间34min； 10kb以上的靶序列 延伸时间15min。 2 循环次数 PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在2540次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,加样,PCR流程,PCR的优点,1 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： 引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。 2 灵敏度高 能将pg级的起始待测模板扩增到ug水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 3 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行扩增反应，一般在24小时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 4 对样本DNA的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA样品进行PCR检测。,PCR技术的应用,PCR技术从原理便知该技术与基因有关，因此，它可以运用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面,示例,基因克隆,PCR技术的临床应用,PCR技术因与基因相关，因此，在临床上的应用也是和基因有关的疾病检测 例如：对遗传病相关基因的检测 如果碱基突变的位置与某种限制性内切酶的识别位点相关，图便会产生新的或消除原有的内切酶位点，那么用特定的限制性内切酶消化PCR产物，通过电泳技术与正常人对比就能得治是否有突变，借此诊断遗传病 如：苯丙酮尿症，镰刀型贫血症，血友病等遗传病,PCR技术与病原微生物的检测,根据病毒或其他病原体的已知保守核苷酸序列设计出引物，对待测核酸的特异性片段进行扩增，之后对扩增产物进行电泳分析，通过是否能扩增出特异性条带来判断样品中是否有病原DNA 类似刚刚的遗传病诊断 由于PCR技术具有敏感、专一等特点,不仅可以对病原微生物进行特异性识别,而且可以鉴别同一种类病原微生物的致病性菌株和非致病性菌株,因此应用PCR技术进行病原微生物的检测具有