课件：毛细管电泳.ppt

毛细管电泳,Capillary Electrophoresis, CE 第一组 李平,毛细管电泳：又称高效毛细管电泳，是近年来发展最快的分析方法之一。,是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。,毛细管电泳发展概述,1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75m内径毛细管柱内用高电压进行分离, 创立了现代毛细管电泳。 1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。 1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。19881989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。 短短几年内, 由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求, 得到了迅速的发展。,利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。 按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳； 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。,经典电泳分析,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了细内径的毛细管（ 2-75 m ）； 二是采用了高达数千伏至数万伏的电压 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加， 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,高效毛细管电泳（High-Performance CE）,高效毛细管电泳的特点,仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶 分析速度快、分离效率高（高效） 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105107/m理论塔板数； 操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行； 应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；,毛细管电泳类型,1 .单根毛细管 (类型 缩写 说明) 毛细管区带电泳(CZE):毛细管和电极槽灌有相同的缓 冲液 毛细管等速电泳(CITP):使用两种不同的CZE 缓冲液 毛细管等电聚焦(CIEF):管内装pH 梯度介质，相当于pH 梯度CZE 胶束电动毛细管色谱(MECC):在CZE 缓冲液中加入一种或多种胶束 微乳液毛细管电动色谱(MEEKC):在CZE 缓冲液加入水包油乳液 高分子离子交换 毛细管电动色谱(PICEC):在CZE 缓冲液中加入可微观分相的高分子离子 开管毛细管电色谱(OTCEC):使用固定相涂层毛细管，分正、反相于离子交换 亲和毛细管电泳(ACE):在CZE 缓冲液或管内加入亲和作用试剂 非胶毛细管电泳(NGCE):在CZE 缓冲液中加入高分子构成筛分网络,2 单根填充管 毛细管凝胶电泳 CGE 管内填充凝胶介质，用CZE 缓冲液 聚丙烯酰胺 毛细管凝胶电泳 PA- CGE 管内填充聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖毛细管凝胶电泳 Agar- CGE 管内填充琼脂糖凝胶 填充毛细管电色谱 PCCEC 毛细管内填充色谱填料， 分正、反相于离子交换等,3 阵列毛细管电泳 CAE 利用一根以上的毛细管进行CE 操作,4 芯片式毛细管电泳 CCE 利用刻制在载玻片上的毛细通道进行电泳,5 联用 毛细管电泳/质谱 CE/MS 常用电喷雾接口，需挥发性缓冲液 毛细管电泳/核磁共振 CE/NMR 需采用停顿式扫描样品峰的测定方法 毛细管电泳/激光诱导荧光 CE/LIF 具单细胞、单分子分析潜力,毛细管电泳的原理 毛细管电泳分离模式 毛细管电泳的进样与检测 毛细管电泳的应用,一、毛细管电泳的原理,毛细管电泳： 是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。,粒子在电场的作用下，以不没的速度向电荷反方向迁移和现象，是一种在空芯、微小内径的毛细管（内径10200um）中进行的大、小分子的高效分离技术，毛细管两端分别浸入缓冲液中分别插入连有高压电源的电极，该电压使得分析样品沿毛细管迁移，根据被分离物之间电荷和体积的不同，各种分子在高电压下被分离，在自由区带毛细管电泳中，电泳的移动（带电荷分子朝相反极性的电极方向移动）和电渗流（在毛细管内壁上的电荷和应用的势能而引起的电解质移动）导致了分离。,电渗流的大小取决于电场强度、电解质的PH、缓冲液的组成和离子强度、内磨擦和毛细管表面的等特点，这些因素能单一或互相结合地提高分离效果，检测可使用UV直接通过毛细管上的小窗口进行检测，也可选择激光诱发荧光、二极管阵列、电化学和质谱检测器检测。样品进样方式是应用气压或电压将样品压入毛细管中完成。高效毛细管电泳具有多样化分离模式，其分离的机理是不同的，它们之间具有相互补充的作用。,二、毛细管电泳的分离模式,毛细管区带电泳（Capillary Zone Electroporesis，CZE） 分离原理：毛细管区带电泳出称为自由溶液毛细管电泳，是毛细管电泳是最简单的一种形式。其分离机理是基于各被物质的净电荷与质量之间比值的差异，不同离子按照各自表面电荷密度的差异，以不同的速度在中解质中移动而导致分离，它要求缓冲液具有均一性，毛细管内各处具有恒定的电场强度，是目前应用最广的一种分离模式。适用于蛋白质、氨基酸、多肽类和离子的分析。毛细管中除电解液外，无需填充任何物质，操作容易，自动化程度高。,毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis，CGE） 分离原理：凝胶电泳是凝胶移到毛细管中用为支撑物进行分离的区带电泳。凝胶是一种固态的分散的体系。具有多孔性，类似于分子筛的作用，被分离物在通过装入毛细管内的凝胶力，按照各自分子的体积大小逐一分离，分子体积大的首先被分离出来，适用于生物大分子的分析，可纯粹按分子体种大小进行分离（SDS-PAGE），以决定蛋白质的分子量，可以识别一个碱基差异的寡核苷酸，可分离DNA片段，如微卫星（STR）分析，可改变凝胶的浓度不控制分离的范围，如PCR产物的分析。,胶束电动斩学毛细管色谱（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography，MECC） 分离原理：是电泳技术和色谱技术的交叉，当把离子型表面活性剂加入缓冲液中，并且其浓度足够大时，这种表面活性剂的单体就结合在一起，形成球体（胶束）。目前以十二烷基磺酸钠（SDS）胶束用的最为普遍，MECC存在二个相之间分配，由于它们在胶束中具有保留能力而产生不同的保留时间，和CZE一增，缓冲液在管壁处形成正电，产生强烈的向负极方向移动的最渗流，面SDS胶束由于外壳带负电性，具有向正极迁移的倾向，一般电渗流的速度胶束向正极迁移速度，迫使胶束最终以较低的速度向负极移动。中性粒子之间的分离是根据其本身的疏水性的不同而达到的，不同疏水性的粒子和胶束的相互作用不同。疏水性强的作用力大，保留的时间长。 MECC是目前惟一既能分离中性离子又能分离带电组分的HPCE模式。,等电聚焦电泳（Isoelectric Focusing，IEF） 分离原理：两性电解质在分离介质中的迁移，在毛细管内形成pH梯度，各种具有不同等电点的多肽和蛋白质按照这一梯度迁移到其不同的等电位置并停下，由此产生一条非常窄的聚焦区带，利用等电点的细微差异进行分离，将不同的蛋白质聚焦在不同的位置上后，阴极的缓冲液换成盐类，再加上高压，使末端引起梯度降低，让组分一个个通过检测器可求得精确的等电点。,等速聚焦电泳（Isotachophoresis，ITP） 分离原理：在被分离组分与电解质一起向前移动的同时进行聚焦分离的电泳方法，与IEF一样，ITP在毛细管中的电渗流为零，缓冲系统由前后两种不同淌度的电解质组成，分离时毛细管内首先导入尾随电解质（淌度低于被分离组分）。在强电场的作用下，各被分离组分在两种电解质之间的空隙是发生聚焦分离。 选择处理或未处理硅交毛细管均右，电渗流可用0.25%羟脯氨酰甲本纤维抑制.前导电解质:5nM磷酸,尾随电解质:缬氨酸,在分离开始时,电流会由于高淌度的电解质完全充满毛细管而迅速增大,进入分离过程时,电流会随着低淌度的电解质进入毛细管而下降.,毛细管电色谱(capillary electrochromatography,CEC) 分离原理:是将高效液相色谱众多的固定相填冲到毛细管中,以样品与固定相间的相互作用为分离机制,以电流流相为驱动力的色谱过程.,2019/4/20,25,可编辑,亲和毛细管电泳(affinity capillary electrkphoresis,ACE) 分离原理:在电泳过程中具有生物专一性亲和力,即受体(recepror)和配体(ligand)相互间发生的特异亲和作用.形成了受体的配体的复合物.对受体和配体在发生亲和作用前后的电泳图谱变化,可获得有关受体和配体亲和力大小结构变化作用产物等方面的信息.,电动色谱(electrokinetic chromatography,EKC) 分离原理:是根据电动现象命名的一种电泳模式,涉及电渗, 电泳和色谱三方面的原理, 主要用于手性化合物的 分离.,非水相毛细管电泳(non-aqueous capillary electrphoresis,NACE) 分离原理:是分析物在有机溶剂中进行电泳分离的一种模式,使用非水相介质可增加方法的选择性,并有利于非水溶性物质的分离.,毛细管电泳的缺点是：,（1） 由于进样量少，因而制备能力差； （2） 由于毛细管直径小，使光路太短，用一些检测方法（如紫外吸收光谱法）时，灵敏度较低； （3） 电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性。,三、毛细管电泳设备系统,1 毛细管电泳流程与电泳仪主要部件,目前毛细管电泳仪的生产厂家有十几家，产品的型号很多。但是毛细管电泳仪的基本结构相差不大，主要由进样与清洗、电极槽及其移动控制、毛细管及其温度控制、直流高压电源、检测器、数据记录与处理等几部分组成。,(1)高压电源,（1）030 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； （4）电压稳定性：0.1%； （5）电源极性易转换；,(2) 毛细管柱 （1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差； （2）规格：内径2075m，外径350400m；长度=1m,毛细管的改性 通常在毛细管内壁涂一层亲水性非离子型聚合物(如：聚丙烯酰胺、甲基纤维素等)，这些涂层提高了对生物大分子分离的效率。涂层的方法有两种。 物理涂层：将涂料经适当处理在毛细管内侧形成一层薄膜 化学涂层：是将涂料通过化学键偶联在毛细管的内侧。,(3)缓冲液池,化学惰性，机械稳定性好； (4)检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测； 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；,影响分离因素,缓冲液 缓冲试剂的选择主要由所需的pH决定，在相同的pH下，不同缓冲试剂的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。CE中常用的缓冲试剂有：磷酸盐、硼砂或硼酸、醋酸盐等。,pH值 缓冲体系pH的选择依样品的性质和分离效率而定，是决定分离成败的一大关键。不同样品需要不同的pH分离条件，控制缓冲体系的pH值，一般只能改变电渗流的大小。pH能影响样品的解离能力，样品在极性强的介质中离解度增大，电泳速度也随之增大，从而影响分离选择性和分离灵敏度。,分离电压 在CE中，分离电压也是控制电渗的一个重要参数。高电压是实现CE快速、高效的前提，电压升高，样品的迁移加大，分析时间缩短，但毛细管中焦耳热增大，基线稳定性降低，灵敏度降低；分离电压越低，分离效果越好，分析时间延长，峰形变宽，导致分离效率降低。,温度 温度影响分离重现性和分离效率，控制温度可以调控电渗流的大小。温度升高，缓冲液粘度降低，管壁硅轻基解离能力增强，电渗速度变大，分析时间减短，分析效率提高。但温度过高，会引起毛细管柱内径向温差增大，焦耳热效应增强，柱效降低，分离效率也会降低。,添加剂 在电解质溶液中加入添加剂，例如中性盐、两性离子、表面活性剂以及有机溶剂等，会引起电渗流的显著变化。,毛细管电泳 的 进样与检测,1 毛细管电泳进样方法,(1) 电动式进样 电迁移进样(Electrokinetic)： 将毛细管的阳极直接与样品接触，短时间内施加电压，使样品通过电迁移的方式进入毛细管的阳极端。 进样量：与溶质浓度，加电压的强度E，电迁移时间t，电迁移速度Vep，电渗速度Veo等因素有关。 优点：进样准确，容易控制重复性好。 缺点：对浓度低的组分有歧视效应。,电击进样: 在毛细管的阳极端通过电击方法将样液送入毛细管内。 进样量：与溶质浓度C，电击所使用的功率，电击次数等因素有关 优点：应用广泛， 缺点：上样量不容易控制。,(2) 流体力学进样 虹吸进样： 进样时将阳极槽抬高形成槽的落差，利用液体重力差将样品吸入阳极端的毛细管内。 进样：量与落差、样品浓度、进样时间成正比，与样液粘度成反比 优点：操作简便，重复性好。 缺点：比较适于自由电泳，而不是与凝胶电泳。,加压进样： 进样时将阳极端密闭，施加一定的液压把样品吸入毛细管内。 进样量：与液压强度、样品浓度、进样时间成正比，与样液粘度成反比,真空进样: 利用两端的气压差将样品送入毛细管内。 进样量：与真空度、样品浓度、进样时间成正比，与粘度成反比。,紫外吸收检测,2 毛细管电泳检测方法,检测器 检测限（mol/L） 特 点 UV可见吸收 10-510-6 近似通用，常规应用 荧光 非相干光诱导 10-710-8 灵敏，但试样通常要衍生 激光诱导 10-1010-12 高灵敏度，价格昂贵，要衍生化 电化学 电导 10-510-7 通用性 安培 10-810-9 选择性，灵敏度高，微量 质谱 10-710-9 仪器复杂，可获结构信息， 质量灵敏度高 放射 10-910-11 灵敏度高，操作有特殊要求,不同检测方法比较,毛细管电泳的应用,质谱联用 Olivares，Smith和Henion等分别在1987-1988年提出毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）技