生物技术实验教学大纲.doc

生物技术实验教学大纲课程编码: 08051257 实验学时:18 实验学分:1一、本实验课的性质、任务与目的本课程是一门专业基础实验课，综合了生物化学技术、微生物技术、细胞工程、生化工程、微生物工程等方面的实验内容，在注重专业基础性和可操作性的前提下突出先进性和系统性，加强教学内容的选择性。通过本课程的学习和实践，要求学生掌握细胞工程技术、微生物学技术以及相关领域的实验原理和方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术以及相关领域的科学研究工作打下基础。二、实验基本要求调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备、设计具体实验方案，适时组织学生外出自取实验材料，让学生和教师共同讨论理论和实验问题。成绩评定要把学生的实际动手能力和创新精神放在重要地位。实行课堂讲授指导辅以多媒体演示。指导学生分析总结实验结果，学会正确书写科学论文。本课程可根据实验设备等具体情况，安排下列实验中的6-8个实验，每个实验3学时。三、实验项目与要求：序号实验项目名称时数项目要求项目类型项目性质目的要求1植物组织培养实验室参观3必修操作验证掌握植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。2PCR基本原理和方法3必修操作验证掌握DNA提取的方法，以及DNA的基本量的概念。3DNA提取3选修操作验证了解PCR扩增的基本理论及过程。4电泳技术3必修操作验证DNA 的琼脂糖凝胶电泳5甜酒酿的制作3选修操作设计学习掌握微生物菌种保藏的原理和基本方法。6植物组织培养基的配置3选修操作设计学会使用紫外分光光度法测定DNA 浓度、学习和掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。7微生物的单细胞分离3选修操作验证学习微生物单细胞分离的原理，掌握微生物单细胞分离的方法。注：1、项目要求：必修、选修、其他；2、项目类型：演示、操作、模拟；3、项目性质：验证、综合、设计、研究。四、成绩考核方式及评分标准平时实验报告50，期未实验操作考试25，期未实验理论考试25%。五、主要实验教材（指导书）及参考用书 生物技术实验与仪器操作指南，李多伟等编 西北大学出版社，1996年细胞生物学实验杨汉民 主编 高等教育出版社 1997年7月第二版撰稿人： 王沛政 审稿人： 系主管领导： 系办盖章： 年 月 日试验一、植物组织培养实验室参观一、了解实验室建设要求 理想的组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。规模化生产的组织培养实验室最好建在交通方便的地方，便于培养产品的运送。 实验室的建设均需考虑两个方面的问题：一是所从事的实验的性质，即是生产性的还是研究性的，是基本层次的还是较高层次的；二是实验室的规模，规模主要取决于经费和实验性质。 无论实验室的性质和规模如何，实验室设置的基本原则是：科学、高效、经济和实用。一个组织培养实验室必须满足3个基本的需要：实验准备（培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌）、无菌操作和控制培养。此外，还可根据从事的实验要求来考虑辅助实验室及其各种附加设施，使实验室更加完善。二、实验室组成 （一）基本实验室 基本实验室包括准备室、洗涤灭菌室、无菌操作室、培养室、缓冲间，是组织培养实验所必须具备的基本条件。如进行工厂化生产，年产4万-20万，需3-4间实验用房，总面积60平方米。 1、准备室（化学实验室）功能：又叫化学实验室，进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。 要求：最好有20平方米左右。要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。 设备：准备室应具备实验台、药品柜、水池、仪器、药品、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器等。 2、洗涤灭菌室功能：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。要求：洗涤灭菌室根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还 应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿，地面应耐湿并 排水良好。 设备：水池、落水架、中央实验台、高压灭菌锅、超声波清洗器、干燥灭菌器（如烘箱）等。3、无菌操作室（接种室）功能：也叫接种室，主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。 要求：接种室宜小不宜大，一般78平米（10-20平米）即可，其规模根据实验需要和环境控制的难易程度而定。 设备：紫外灯、空调、解剖镜、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针），实验台、和搁架，还有超净工作台和整套灭菌接种仪器、药品等。 4、培养室 功能：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，无论是研究性实验室还是生产性实验材料进行培养的场所。要求：约需 10-20平方米左 右。 设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、转床、自动控时器、紫外灯、光照培养箱或人工气候箱、生化培养箱、边台实验台用于拍摄培养物生长状况，除湿机、显微镜、温湿度计、空调等。5、缓冲间 功能：是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌室和培养室。 要求：缓冲间需3-5平方米，可建在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；墙顶用1-2盏紫外灯定时照射，对衣物进行灭菌。 缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。设备：1-2盏紫外灯、水槽、实验台、鞋帽架、柜子、灭菌后的工作服、拖鞋、口罩。 （二）辅助实验室 根据研究或生产的需要而配套设置的专门实验室，主要用于细胞学观察和生理生化分析等。 1、细胞学实验室 功能：用于对培养物的观察分析与培养物的计数，对培养材料进行细胞学鉴定和研究，由制片室和显微观察室组成。2、生化分析实验室 功能：培养细胞产物为主要目的的实验室，应建立相应的分析化验实验室，随时对培养物成分进行取样检查。大型次生代谢物生产，还需有效分离实验室。 三、仪器设备和器皿用具 一、基本设备配置 （一）常规设备 1、天平 组织培养实验室需要2-3台不同精度的天平。 感量0.001g的天平（分析天平）和感量0.0001g的天平（电子天平）用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品。 感量0.01g和0.1g的天平，用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。2、冰箱3、酸度计 4、离心机 5、加热器 用于培养基的配制。研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器，规模化大型实验室用大功率加热和电动搅拌系统。 6、其它 纯水器、分装设备 （二）灭菌设备 维持相对得无菌环境是组织培养实验室的基本要求。 1、高压灭菌锅 2、干热消毒柜 用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的灭菌。一般选用200左右的普通或远红外消毒柜。 3、过滤灭菌器 4、紫外灯 （三）无菌操作设备 1、接种箱 2、净化工作台 （四）培养设备 1、培养架 2、培养箱 3、摇床 4、生物反应器 （五）其他设备 可安装时间程序控制器、温度控制系统或空调；实体显微镜、倒置式生物显微镜及配套的摄影、录像和图像处理设备；电泳仪、萃取和层析设备、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、气相色谱仪、酶联免疫测定系统。 四、培养容器与用具 （一）培养容器 包括各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。玻璃容器，一般用无色并不产生颜色折射的硼硅酸盐玻璃材质。塑料容器材质轻、不易破碎、制作方便，广泛使用。一般为聚丙烯、聚碳酸酯材料的培养容器。 （二）金属用具 1、镊子 2、剪刀 3、解剖刀 4、其他用具 接种铲、接种针在花药培养、花粉培养中有用。 （三）塑料用具 各种风口膜、盖、塑料盘及其它实验用具。 试验二、PCR基本原理和方法试验目的: 了解PCR技术的基本原理，设备，药品，过程。试验内容： PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。PCR技术的基本原理一.PCR反应成分：1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2+等。二.PCR反应基本步骤：1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94，30s）。2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55，30s）。3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（7072，3060s）1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。 2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。 3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按53方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。 以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。 试验三、DNA提取一、目的：了解DNA提取过程和相关试剂。二、试验内容和过程：香蕉或菜花；氯化钠或食盐，餐具洗涤液或洗衣粉（皂）液，95%乙醇或普通白酒（60度），生理盐水，二苯胺试剂；天平，研钵，量筒，纱布，烧杯，试管，玻璃棒，酒精灯，石棉网，试管夹。洗涤液中含有十二烷基硫酸钠和碱，它们可使细胞膜破裂，蛋白质变性，使蛋白质与DNA分离开来。DNA不溶于酒精，加入酒精可以使DNA从溶液中析出。利用DNA遇二苯胺变蓝的特性对DNA进行鉴定将30g香蕉或菜花切碎，放入研钵中。向研钵中加入2g氯化钠，研磨直至成半流体状。2、向研钵中加入10ml蒸馏水或凉开水，搅拌。然后加入10ml洗涤剂，轻轻搅拌。3、将混合液用两层纱布过滤，向滤液中加入预冷的10ml乙醇溶液，静置，可产生絮状的DNA。4、取两支试管，分别加入5ml生理盐水，将DNA挑至其中一支试管中，轻轻搅拌使其溶解。5、向两支试管中各加入4ml二苯胺混匀后，放入沸水中加热5min。6、待试管冷却后，观察并比较两支试管中溶液颜色的变化。三、总结与讨论 1、实验中为什么要把实验材料充分切碎？洗涤剂的作用是什么？ 3、乙醇或白酒的作用是什么？试验四、DNA 的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的 （1） 学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；（2） 掌握使用水平式电泳仪的方法；（3） 学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。 二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。（3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1） 能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑， 所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。 三、试剂与器材 （一）材料电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等（二）试剂50TAE Buffer 配制方法： 1. 称量Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g 于1L烧杯中； 2.向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀； 3加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解； 4.加去离子水定容至1L后，室温保存试剂的相对分子量：Tris（121.14）、乙酸（60.05）、EDTA（292.25）、EDTA-Na2（336.21） 、Na2EDTA2H2O （372.21）冰乙酸的密度：1.049g/ml2、 EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。3、 DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40克蔗糖 四、操作方法 （一）常规的水平式琼脂糖电泳制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：琼脂糖的含量（%） 分离线状DNA分子的有效范围（Kb）0.3 60-50.6 20-10.7 10-0.80.9 7-0.51.2 6-0.41.5 4-0.22.0 3-0.11制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。2胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5g/ml的EB溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；3加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 L微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。4电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。5观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。六、 注意事项与提示（1）EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。（2）由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5g/ml的EB溶液浸泡染色的方法。七、 实验安排 只需一天：上午配试剂倒胶，下午跑电泳并观察拍照。 八、实验报告要求与思考题 1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？试验五、甜酒酿的制作一、试验目的：了解甜酒发酵过程，及影响因素。试验原理：利用糯米饭让酵母菌进行发酵，先好氧发酵使其菌体大量繁殖抑制其他杂菌生长，同时代谢过程中产生大量水，最后使酵母菌处于缺氧环境，无氧呼吸产生酒精。酵母菌代谢产物很多，在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长所必需的。这些产物叫初级代谢产物，许多初级代谢产物在经济上具有相当的重要性。二、试验方法：1、 浸泡：将糯米洗净，浸泡12到16小时，至可以用手碾粹即可 2、蒸饭：在蒸锅里放上水，蒸屉上垫一层白布，烧水沸腾至有蒸汽。将沥干的糯米放在布上蒸熟，约一小时。自己尝一下就知道了。没有这层布，糯米会将 蒸屉的孔堵死，怎么也蒸不熟。这有失败的经验。尝一尝糯米的口感，如果饭粒偏硬，就洒些水拌一下再蒸一会。3、淋饭：将蒸好的糯米端离蒸锅，冷却至室温。间或用筷子翻翻以加快冷却。在桌子上铺上几张铝箔，将糯米在上面摊成两三寸厚的一层，凉透。在冷却好的糯米上洒少许凉开水，用手将糯米弄散摊匀，用水要尽量少。4落缸搭窝：将酒曲均匀的拌在糯米中,转入容器, 压实,中间扒一个小窝,然后用保鲜膜或纱布密封. 5、培养成熟：将盆置于30-32度左右的恒温箱中培养24到48小时，如果米饭变软，表示已糖化好；有水有酒香味，表示已有酒精和乳酸，即可停止保温。最好再蒸一下，杀死其中的微生物和酶停止其活动。这样，甜酒酿就制作成功。三、 学习讨论1、一周后，品尝甜酒酿。先品尝本小组酿制的酒，把酒的颜色、味道等现象记录下来。2、小组汇报：教师引导各小组进行交流、讨论。（1）各组展示制作成果，简要阐述制作过程。（2）各组交流成果，品尝、作出评价（3）交换意见：说说成功之处，失败原因（4）自由讨论保存甜酒酿的方法。引导学生进行总结：（）酿制酒酿的原理。（）酿制酒酿的过程。（）制作过程中的体会、收获。设计目的：强化学生的体验，对学生进行情感教育。植物组织培养基的配置MS培养基母液的配制与保存一、目的通过MS培养基母液的配制和保存，掌握配制与保存培养基母液的基本操作技术。二、材料与用具配制MS培养基所需的药品、生长调节物质、天平、烧杯、定容瓶、量筒、蒸馏水、95%的酒精或0.1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl、母液瓶、标签、冰箱等。三、方法与步骤（一） 母液的配制1母液1的配制 （1）称量 用天平称取下列药品, 分别放入烧杯； NH4NO3 82.5g KNO3 95.0g MgSO4 . 7H2O 18.5g （2）混合 用少量蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合； （3）定容 加蒸馏水定容至1000ml，成50倍液。2母液2的配制 （1）称量 用天平称取 CaCl22H2O 22.0g； （2）定容 加蒸馏水定容至500ml，成100倍液。3母液3的配制 （1）称量 用天平称取 KH2PO4 8.5g； （2）定容 加蒸馏水定容至500ml，成100倍液。4母液4的配制 （1）称量 用天平称取下列药品, 分别放入烧杯； Na2-EDTA 1.865g FeSO47 H2O 1.390g （2）混合 用少量蒸馏水将药品分别溶解后混合。 （3）定容 加蒸馏水定容至500ml，成100倍液。5母液5的配制 （1）称量 用天平称取下列药品, 分别放入烧杯； H3BO3 0.31g MnSO44H2O 1.115g ZnSO47H2O 0.43g KI 0.0415g NaMoO42 H2O 0.0125g CuSO35H2O 0.00125gCoCl26 H2O 0.00125g （2）混合 用少量蒸馏水分别将药品溶解，然后依次混合； （3）定容 加蒸馏水定容至1000ml，成50倍液。6母液6的配制 （1）称量 用天平称取下列药品, 分别放入烧杯； 肌醇 5.0g 甘氨酸 0.1g 烟酸 0.025g VB6 0.025g VB1 0.005g （2）混合 用少量蒸馏水分别将药品溶解，然后依次混合； （3）定容 加蒸馏水定容至250m