细胞系与细胞克隆研究生教学.ppt

,细胞系与细胞克隆,教学目的：,1、掌握传代培养的概念和方法 2、了解细胞系的建立过程 3、掌握克隆细胞的几种方法,细胞系cell line：原代培养物经首次传代后即成。 有限细胞系finite cell line: 不能继续传代或传代数有限。 连续细胞系continuous cell line：可连续传代的细胞系，即已建成的细胞系。 细胞株cell strain：通过选择法和克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质和标志的培养物。,有关概念,一、传代培养（passage）,概念：无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。,（一）传代培养的方法 1、从生长器皿上解离细胞的方法： 1）震荡法。 2）胰蛋白酶消化法 3）胰蛋白酶-柠檬酸盐 4）用EDTA洗细胞再用胰蛋白酶-柠檬酸盐处理 5） EDTA洗再用胰蛋白酶-EDTA消化 6） EDTA洗再用胰蛋白酶-胶原酶配合柠檬酸盐或 EDTA消化 7）机械刮削法（scraping） 8）分散酶（0.1mg/ml)或蛋白酶(0.1-1.0 1mg/ml),2.单层培养细胞的一般传代步骤:,倒出旧液,PBS洗涤,胰蛋白酶消化,吸出消化液,加入培养液,吹散细胞,计数,稀释,培养,离心法：离心后去上清，加培养液，吹 打，传代。 直接传代法：将细胞慢慢沉淀，将上清吸去1/2-2/3，加培养基，传代。,3、悬浮细胞的传代培养,(二) 传代培养的注意事项,1、传代时机与传代培养的细胞密度：细胞没生长到足以覆盖的瓶底壁的大部分表面前，不要急于传代。 2、传代数或代数：指对培养物传代的次数。 3、尽量少传代，避免转化。,二、细胞系的建立,正常细胞系建立的程序包括： 原代培养 第一次传代 常规传代和冻存、 复苏等阶段。,细胞系的维持,细胞系档案要记录好：组织来源、培养基要求、传代时间等； 传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变； 多种细胞维持传代，要防止交叉污染； 要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；另外，细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。,1、证明细胞系的种系。染色体分析、同工酶分析、DNA指纹技术。 2、明确细胞系的组织来源 细胞抗原标记的方法 3、细胞是否是正常细胞，有无发生恶性转化正常细胞二倍体特征，恶性转化细胞为异倍体。 4 、 细胞有无交叉污染 。同工酶方法是快速有效的，每一个细胞系在琼脂糖电泳上有特异的同工酶带型。DNA指纹技术也可以鉴定。,鉴定细胞系的内容：,三 、细胞克隆,细胞克隆（clone）是指单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。 细胞克隆化培养（cell cloning culture）：又称单个细胞分离培养，是指将单个细胞在一定支持物上增殖培养而产生细胞群落的过程。,（一）克隆培养技术,稀释铺板法 饲养层克隆法 胶原膜板 琼脂克隆法等,分类：,1.稀释铺板法：最常用 消化低密度细胞悬液制备接种标记与培养分离扩大培养观察移植瓶或皿内培养,稀释铺板法图解,注意事项： 1）确保一个细胞 2）轮廓清晰完整，体积适宜健康 3）不需换液,2、饲养层克隆法 饲养细胞（feeder cell）：也称滋养细胞，是一层经过射线或丝裂霉素C处理过的供其它细胞附着的细胞层。成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞。 注意：3周内饲养细胞即死亡，要及时应用,饲养层克隆图解,3、胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法： 1）胶原膜板或血纤维蛋白膜板的制备 2）消化、稀释、接种和培养待克隆细胞 血纤维蛋白膜板制备 A液：0.2g凝血酶,100ml培养液 B液:250mg 牛血纤维蛋白原、800mg NaCl、25mg 柠檬酸钠、1000毫升双蒸水 A：B=4：1,4、琼脂克隆法： 用于病毒转化细胞、恶性转化细胞。 2%琼脂母液-45水浴-混合成0.33%琼脂培养液加入试管内 2.5ml- 45水浴,琼脂克隆法图解,5、在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化 2%琼脂母液-45水浴（琼脂母液和2倍浓度培养液）-1：1混合- 45水浴铺板细胞悬液内加等体积的1.5%甲基纤维素混合后铺于琼脂层上培养,在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化图解,（二）影响克隆形成率的因素,克隆形成率 (cloning efficiency)是指向底物接种单细胞悬液能形成细胞小群的百分数,影响因素： 1、细胞密度。10个/ml 2、培养液。HamF12k 3、血清 4、饲养细胞 5、激素和生长因子：胰岛素，地塞米松，EGF，BFGF。 6、CO2 7、适应性生长基质：胶原层，血浆纤维蛋白层，多聚右旋赖氨酸，纤维连接蛋白，琼脂,（三）克隆的分离,克隆化环分离法,2、射线照射分离克隆法 将培养瓶倒置放于X射线或 钴60源下，用2mm厚的铅片盖住选中的克隆。 3、悬浮细胞克隆分离 24孔板加入1ml培养液用毛细吸管吸取群落吹入培养板内,1