柱层析、固相萃取和制备色谱.ppt

柱层析、固相萃取和制备色谱,分析过程中各步骤花费的时间,样品前处理 61% 采样6% 分析6% 数据处理27%,分离与富集,分离（separation）的概念 分离是一种假设状态，在这种状态下，不同的物质被分开了（isolation）。 含有m种化学组分的混合物被分成m个常量范围。 把m种化学组分分成m种纯的形式，并把它们置于m个独立的容器中。 利用混合物中各组分在物理或化学性质上的差异，通过适当的装置或方法，使各组分分配至不同的空间区域或者在不同的时间依次分配至同一空间区域的过程。,富集（concentration）的概念： 在分离的过程中使对象物质在某空间区域的浓度增加。 从大量基体物质中将欲测量的组分集中到一较小体积的溶液中，从而提高检测灵敏度。 分离与富集的关系： 富集需要借助分离的手段，在分析过程中分离与富集往往是同时实现的。 富集与分离的目不同，富集只是分离的目的之一。,柱层析法（柱色谱）,柱色谱概述 常用柱色谱介质的分类 柱色谱操作流程,柱色谱-概述,吸附柱层析是利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分分离。 当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附解吸再吸附再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。,常用柱色谱介质的分类,无机物色谱介质 氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙(凝胶型和晶型)、氧化钛和氢氧化锌凝胶等。 聚合物色谱介质 琼脂糖、葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺等。,柱色谱-吸附剂氧化铝,市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型，粒度规格大多为100150目。 碱性氧化铝（pH9-10） ：适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。 酸性氧化铝（pH3.5-4.5）：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。 中性氧化铝（pH7-7.5）：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。,层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。,非极性和极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等,吸附剂硅胶,柱色谱-吸附剂硅胶,柱色谱操作流程装柱,硅胶浸泡于石油醚中，搅拌均匀后一次性倒入柱中,预先加入溶剂,敲打,均匀紧密,柱色谱操作流程装柱,柱色谱操作流程拌样,样品10mg溶于溶剂中，全溶 加拌样硅胶100150目1:1-1.5 搅拌均匀至干 必要时旋蒸至干,柱色谱操作流程-拌样,溶解 搅拌 至干,柱色谱操作流程-上样,均匀加到柱中,柱色谱操作流程-洗脱与接收,用不同比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱 每个极性洗脱35个保留体积 每个保留体积接收1020份馏分 整个过程加低压,柱色谱操作流程-浓缩,浓缩方法 溶剂浓缩 自然挥干 减压浓缩 冻干,柱色谱操作流程-薄层鉴定,吸附剂：硅胶CMC 展开剂：C6H6EtoAc(3:2或97：9) 显色剂：（1）氨蒸气熏。（2）5%KOH喷雾,制备色谱,第一部分.制备HPLC概述 第二部分.制备HPLC技术问题 上样 条件的选择 循环色谱 柱切换,制备HPLC概述,制备色谱到底是什么？ 结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。,制备HPLC概述 制备HPLC与分析HPLC比较,制备HPLC概述主要结构单元,输液部:输液泵 分离部:制备柱 检测部:检测器 馏分部:馏分收集器,制备HPLC概述对仪器的要求,制备泵的耐压 制备HPLC系统因制备柱的填料很细，分离度好，同时反压很高，整个系统对压力很敏感，制备泵要求能在制定的恒流量下, 克服100 - 150 bars反压 色谱柱的柱容量（柱负荷） 不影响收集物纯度时的最大进样量；一般都超载进样。但进样量超过柱容量，柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。,制备HPLC概述分离效能,取决于分离速度、分辨率和上样量。对某一个分离参数进行优化常会影响到其他分离参数。,增加洗脱液流速会降低分辨率，分辨率也会因上样量过大而下降。但分辨能力并不总是制备HPLC首要考虑的因素，制备型 HPLC应首先具有经济、快速的生产所需产品的能力。,在许多分离工作中，需要从大量的物质中分离纯化不足的所需成分，这种分离工作十分困难，在纯化的最后阶段常需使用m或更小颗粒的高效填料。为获得所需微量组分，可采用如下手段： 制备型分离-半制备型分离-分析型分离-产物。,制备HPLC概述分离效能,制备HPLC有关技术问题超量进样,大样品量的纯化方法,分析系统的放大: 使用直径更大的制备柱、更高的流速，根据色谱柱的长度增加进样量并保持样品浓度不变，峰形尖锐而对称。需大型的色谱柱和大量的溶剂来分离较少的样品，不经济,色谱柱超量载样：相同的条件下超量进样,浓缩法和 体积超载法,制备HPLC的首要问题是快速、高效的制备色谱纯的产品！,分离度不是首要问题， 色谱峰会比较难看！,制备HPLC技术问题组分的收集,制备HPLC技术问题样品的初步纯化,在利用制备HPLC最终纯化步骤前做一些初步纯化是提高效率降低成本的优化措施. 比如最终纯化通常有一定的分离难度,又希望有足够的收率,所以使用的仪器和填料可能是昂贵的.未经预纯化的样品,尤其是天然产物,含有大量的可能在填料表面不可逆吸附的组分,直接进样,可导致昂贵的填料很快失效. 此外,大量的杂质降低对目标产物分离度,因此限制了进样量和生产效率. 同时分别用正反相色谱去除前后杂,比单用一种色谱得到目标产物更简单易行. 总之,制备色谱尤其是工业色谱的目标不仅是找到技术上可行的方法,而且要综合考虑成本.,上样量主要根据柱子的大小、样品的浓度和制备是否根据分析条件放大（例如制备柱是否还用分析用填料） 根据内径计算：内径放大N倍，进样量大致可放大N平方倍（柱长一定时）,制备HPLC技术问题上样量的选择,将分析色谱上的结果放大到制备色谱中：,上样量的调整： mp/ma=lp/la * r2p/r2a L:柱长；m：进样量；r：色谱柱内径 p: 制备柱；a：分析柱,制备HPLC技术问题条件的选择,从分析方法到制备方法的放大和方法的优化需要三个步骤： 1. 优化分析方法的选择性。 2. 在分析柱上进行超量载样。 3. 放大到制备柱。 线性放大 非线性放大,制备HPLC技术问题条件的选择,线性放大 指柱直径、长度（即柱体积）和流速等可以根据加样量的增加情况进行按比例线形放大。制备色谱中，最好的线形放大是在其他工艺条件不变的情况下，只改变柱子和流速，就可以放大生产，同时分离效果保持不变。成本比较大，同时也大大减少生产的产量和速度 非线性放大,制备HPLC技术问题条件的选择,流速的调整 梯度洗脱 分离效果取决于梯度的选择，理论上梯度越小，分辨率越高。在分析上摸好条件，上制备柱往往还要降低一些洗脱液的浓度。 柱子再生 依次用水，甲醇，四氢呋喃，氯仿，甲醇来冲洗柱子，每种溶剂5-10个柱体积。,制备HPLC技术问题条件的选择,1）制备的目的是在一次操作中尽可能地多上样，所以，首先得在分析柱上实现超载，否则，分析柱分离得再漂亮，再在制备柱中线性放大时就因为成本不合理而被无情地否决。 2）制备的目的是分离你所关心的组分，只要它能与其它杂质分离的好就行了，所以不要希望在分析柱上先得到所有组分的基线分离，完全没有必要！设计梯度时只需对目的物前后5-10%梯度的范围进行精细分离。,制备HPLC技术问题条件的选择,3）制备中常常因为超载而无法使目的物与邻近杂质间达到基线分离，可以采用分段收集的方法得到指定纯度的目的物，要求越纯，单次操作的得率也越低。 4）制备中因为目的物来之不易，常常需要将纯度不合格得目的物重新上柱循环，一般只需稀释1-2倍就可以了。由于重新上柱是会增加成本的，所以超载的量要平衡单次操作的纯品得量和效益与返工成本，以单位纯品数量进行成本核算，以优化最佳上样量。,固相萃取技术SPE,一. SPE基本原理 二. SPE法的优点 三. SPE装置 四. SPE柱填料类型 五. SPE分析方法的建立 六. SPE的应用,SPE-基本原理,定义：利用固相吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和和富集的目的。 分离：杂质保留或目标化合物保留。 富集：目标化合物保留，化合物极性与吸附剂极性越接近，保留越强。 分离机理：利用杂质或目标化合物与样品基体溶剂和吸附剂之间亲和力的相对大小。,SPE-基本原理,SPE也是一个柱色谱分离过程，分离机理、 固定相和溶剂的选择等方面与HPLC有许多相似之处。 SPE柱的填料粒径（40m）要比HPLC填料（3-10m）大。由于短的柱床和大的粒径，SPE柱效比HPLC色谱柱低得多。 SPE只能分开保留性质有很大差别的化合物。 SPE柱是一次性使用。,SPE-优点,许多分析方法中已经替代了液-液萃取 节省分析时间 减少有机溶剂的使用，不污染环境 高效、快速，可同时处理多个样品 提高分析质量，减少背景的干扰 提高了回收率,固相萃取所需时间为液液萃取的1/2，费用为液液萃取的1/5。,SPE柱,最简单的固相萃取装置就是一根直径为数毫米的小柱由医用聚丙烯管，多孔筛板，填料三部分组成。 小柱可以是玻璃的，也可以是聚丙稀聚乙烯聚四氟乙烯等塑料的，还可以是不锈钢制成的。 规格：100mg/1mL， 200mg/3mL，300mg/3mL， 1g/6mL， 2g/12mL。,SPE柱的选择,被萃取样品的质量不超过柱中填料量的5%！,SPE柱及其配套装置,自然淋洗-简易支架 加正压 -注射器 加负压 -真空装置,SPE常见填料类型,1.硅胶和键合硅胶 2.高分子聚合物 3.其他吸附型填料，如氧化铝、硅藻土 4.混合型或专用柱系列,SPE柱常见填料类型硅胶表面,SPE常见填料类型键合相硅胶,键合相硅胶，是在硅胶表面的硅醇基团上键合不同的有机基团，如烷基链或其它官能团，如-OH、-C6H5、-NH2、-CN等。实际上吸附剂角色是由这些新接上的含官能基碳链来完成。,SPE柱常用填料类型,按保留机理分为： 正相：Silica、NH2、CN、Diol、Florisil（硅酸镁载体）、Alumina 反相：C18、C8、C2、环己烷基、苯基、CN 离子交换：苯丙磺酸SCX、三甲基丙基胺 SAX、COOH、NH2 混合型：SCR、SAR,SPE柱操作流程,SPE方法的建立柱预处理,柱预处理目的: 除去填料中可能存在的杂质； 使填料溶剂化，提高固相萃取的重现性。填料未经预处理或者未被溶剂湿润，能引起溶质过早穿透，影响回收率。,SPE方法的建立柱预处理,SPE预处理的方法 正相类型固相萃取硅胶和极性吸附剂介质，通常用样品所在的有机溶剂来预处理。 反相类型硅胶和非极性吸附剂介质,通常用水溶性有机溶剂如甲醇、乙腈、四氢呋喃和丙酮预处理,然后用水或缓冲溶液。 离子交换填料将用于非极性有机溶剂中的样品,其用3-5ml的去离子水或低浓度的离子缓冲溶液来预处理。,SPE方法的建立加样,预处理后，试样溶液被加至并通过SPE柱。在该步骤，分析物及杂质被保留在吸附剂上。 为了防止分析物的流失，试样溶剂强度不宜过高。当以反相机理萃取时，以水或缓冲剂作为溶剂，其中有机溶剂量不超过10%（V/V）。,SPE方法的建立洗脱,除去干扰杂质-Wash,用中等强度的溶剂，将干扰组分洗脱下来， 同时保持分析物仍留在柱上。,分析物的洗脱和收集-Elution,这一步骤的目的是将分析物完全洗脱并收集在最小 体积的组分中，同时使比分析物保留更强的杂质尽 可能多地仍留在SPE柱上,洗脱溶剂的强度是至关重要的！,SPE方法的建立洗脱,从SPE的操作步骤可以看出，SPE的重现性受多个因素的影响，实验条件是影响重现性的主要原因。提高重现性的方法有 （1）使用替代物，加入适当的替代物做参比； （2）加入样品量适当，不超出穿透量和穿透体积； （3）选择合适的洗涤液和洗脱液，确保分析物在操作中不流失。,SPE方法的建立选择合适的柱子,正相萃取柱，填料为极性，适用于从非极性溶剂样品中吸附极性化合物。 反相萃取柱，填料为非极性，所萃取的目标化合物通常是中等极性到非极性化合物 。 离子交换固相萃取，填料是带有电荷的离子交换树脂，所萃取的目标化合物是带有电荷的化合物,SPE方法的建立选择合适的柱子,固相萃取中柱填料的选择主要是根据目标化合物的性质和样品溶剂性质。 要尽量选择与目标化合物极性相似的填料。例如：萃取碳氢化合物（非极性）时，要采用反相固相萃取（此时是非极性吸附剂）。当目标化合物极性适中时，正反相固相萃取都可使用。 样品基体是强非极性溶剂，如正己烷，二氯甲烷等，一般要选用正相柱分离。 样品基体是强极性溶剂，如水和甲醇，乙腈及丙酮的混合液，要选用反相柱分离。,SPE方法的建立举例说明,水中多环芳烃（PAHS）的测定 1.使用6ml固