质粒的提取与纯化.ppt

实验一 质粒的提取(碱法),实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论,实验目的,了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法。,实验原理,质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。,结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等,pBC SK map,T-载体,在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。,实验仪器、材料与试剂,（一） 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器,（二） 材料,含pBC KS质粒的大肠杆菌 DH 5。 含重组质粒的大肠杆菌 DH 5。,（三） 试剂,1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基（1L） 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。,2. Solution 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 高压灭菌后，4保存备用。 3. Solution(现用现配制) 0.2 mol/L NaOH 1% SDS,4. Solution （100 ml） 5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 （pH 4.8）。 5. 氨苄青霉素（Amp） 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20冰箱保存备用。,6. 胰RNA酶 将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20。 7. 氯仿，乙醇 ，70%乙醇。,实验步骤,质粒的提取 1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37振荡培养过夜。 2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，去掉上清液，重复两次。沉淀悬于200L SolutionI 中, 涡旋使充分悬浮。 3. 加入300L SolutionII，混匀（注意动作轻），冰箱3 放置5min。 4. 加入300L SolutionIII,混匀（注意动作轻） ，冰箱3 放置5min。,5. 12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf 管中，注意所取体积（约600 L ） 。 6. 加入等体积氯仿（约600 L ），混匀（注意动作轻）。12,000rpm，4，离心10min，取上清液。 7. 上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20沉淀 2030 min。 8. 12,000 rpm离心15 min。,9. 去上清，沉淀加入500L 70%乙醇洗涤2次（ 12,000 rpm离心3分钟）。 10. 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。 11. 每管中加入25L无菌水1L RNase， 37溶解质粒DNA。,Biospin 质粒DNA 小量提取试剂盒（实际用） 操作过程 1. 将11.5ml 过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中。 2. 于10，000rpm离心30 秒，并弃去上清液。 如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。 3. 加250l Resuspension Buffer，重悬细菌体沉淀。 重悬后应该没有细菌团块。,4. 加250l 细胞Lysis Buffer，轻柔颠倒46 次。 不要剧烈振动，以防止基因组DNA 被剪切。注意不要让反应持续超过5 分钟。 5. 加350l Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管46 次。 溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。 6. 于13,000rpm离心10 分钟。 如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。 7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到Spin column 内。于6,000rpm离心1 分钟，并弃去接液管内液体。,8. 向Spin column 内加650l Wash Buffer，于12，000g 离心3060 秒，并弃去接液管内液体。 9. 重复第8 步一次。 10. 再次于12，000rpm 离心1 分钟，然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml 离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。 11. 向Spin column 内加20l Elution Buffer、去离子水或TE 溶液，并于室温静置1 分钟。 可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。,12. 于12，000rpm离心1 分钟，1.5ml 离心管内