山羊黑素皮质素受体—3基因转录水平差异分析.docx

山羊黑素皮质素受体3基因转录水平差异分析 山羊黑素皮质素受体3基因转录水平差异分析 引言 【研究意义】黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊和黔北麻羊是贵州省的优良山羊品种，南江黄羊是四川南江县选育而成的肉用型山羊品种，这5个山羊品种对重峦叠嶂、山高谷深、沟壑纵横的贵州高原山地有很好的适应性，可常年放牧，且育肥性能好，繁殖力强，肉质优良，是贵州存栏量较大的山羊品种。研究其生长及肉质性状的相关基因，对于发展贵州羊肉产业具有重要意义。【前人研究进展】黑皮质素受体（Melanocortin receptor，MCR）基因家族有5个成员，MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R。其中，MC3R是由单一外显子编码的包含323个氨基酸残基的一种跨膜G蛋白耦联受体，是MCR中最晚被克隆和鉴定的一个，具有降低摄食频率控制采食行为、增加能量消耗调节能量平衡、减少脂肪贮量调节体重的功能（Singh et al.，2013；Okutsu et al.，2015；Yang et al.，2015），因此，MC3R基因常作为体重标记的候选基因。苏毅（2006）研究发现鸡MC3R基因1424 SNP位点与屠宰前体重和屠体重、胸肌重、腿肌重及腹脂重显著相关；王彦等（2007）研究发现鸡MC3R基因A1424G突变与屠体性状、腹脂重、皮下脂肪显著相关；李世鹏等（2008）研究发现石岐肉鸽MC3R基因T91G突变与活重、屠体重、全净膛重显著相关；杜鹏等（2010）研究发现比格犬MC3R基因T167A碱基置换对犬体重有显著影响；张轶博和巴彩凤（2013）研究发现北方实验用犬MC3R基因A167T位点突变与其体重、胸围和体重指数等显著相关；薛倩等（2015）从京海黄鸡的MC3R基因编码区序列检测到6个SNP位点，得到5种单倍型和11种单倍型组合，不同单倍型组合间京海黄鸡屠体性状（包括活体重、屠体重、胸肌重、腿肌重、全净膛重、半净膛重和腹脂重）存在显著或极显著差异；张心扬等（2015）在肉鸡高、低脂双向选择品系的研究中发现MC3R基因C273T突变对第六世代和第八世代两个群体的7周龄体重和屠体重有显著本文由收集整理影响。【本研究切入点】目前国内外关于山羊生长和肉质相关基因的研究较多，但鲜见MC3R基因在不同山羊品种及其不同组织中转录水平的研究报道。【拟解决的关键问题】采用双标准曲线和Taqman实时荧光定量PCR对黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊和南江黄羊5个山羊品种的心脏、肝脏、肺脏、肾脏、背最长肌、半膜肌和皮下脂肪中MC3R基因转录水平进行检测，并分析MC3R基因在不同品种及组织间的表达差异，为深入研究山羊MC3R的作用部位、特点及功能提供理论参考。 1 材料与方法 1. 1 试验材料 黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊、南江黄羊的心脏、肝脏、肺脏、肾脏、背最长肌、半膜肌、皮下脂肪等组织采自贵州省雷山县和榕江县。每个品种4只，雌雄各2只，年龄57月龄，体重1417 kg/只。总RNA提取试剂Trizol购自上海英骏（Invitrogen）生物技术有限公司，标准品PCR试剂盒GeneSolution 2Taq Master Mix购自上海硕盟生物科技有限公司，胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，逆转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit和实时荧光定量PCR试剂盒Realtime PCR Master Mix购自东洋纺（上海）生物科技有限公司。主要仪器设备：H1650-W台式微量高速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司），Eppendorf Centrifuge 5415D离心机（德国Eppendorf公司），Ultra Pure UF除热源型超纯水机（上海和泰仪器有限公司），FTC-3000实时荧光定量PCR系统（加拿大Funglyn Biotech公司），Eppendorf Research Plus移液器（德国Eppendorf公司），Mini Centrifuge八联管离心机（Eppendorf公司），BIO-RAD Powerpac Basic电泳仪系统（BIO-RAD公司）。 1. 2 引物及探针 根据NCBI公布的山羊MC3R基因序列（XM_ 005688325.1）及β-actin基因序列（XM_005694067.1）設计标准品引物、定量引物及TaqMan探针（表1），并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。其中，探针的5端标记FAM基团，3端标记TAMRA基团。 1. 3 总RNA提取及cDNA合成 用Invitrogen Trizol RNA提取试剂盒提取各组织样品的总RNA，再用ReverTra Ace qPCR RT Kit逆转录试剂盒制备cDNA。逆转录过程：0.12.0 μg总RNA加RNase-free ddH2O至14.0 μL，混匀，65 变性5 min，冷却。再加5RT Buffer 4.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，RT Primer 1.0 μL，混匀，42 逆转录18 min，然后98 灭活5 min，-20 保存备用。 1. 4 实时荧光定量标准品制备 PCR反应体系：2Taq Master Mix 10.0 μL，10.0 μmol/L的标准品上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板 2.0 μL， RNase-free ddH2O 7.2 μL。扩增程序：94 预变性90 s；94 30 s，60 30 s，72 60 s，进行40个循环；72 延伸5 min，4 保存备用。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，再用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后计算MC3R和β-actin基因的拷贝数浓度，并进行4倍梯度稀释，即得到MC3R基因拷贝数浓度分别为6.781010、1.801010、5.29109、1.32109、3.31108和8.27107 Copies/μL的梯度定量标准品，及β-actin基因拷贝数浓度分别为3.53107、8.82106、2.21106、5.51105、1.38105和3.45104 Copies/μL的梯度定量标准品。 N= 6.021023 式中，N为胶回收产物的拷贝数浓度（Copies/μL），C为质量浓度（ng/μL），M为扩增片段的碱基对数。 1. 5 TaqMan实时荧光定量PCR检测 利用FTC-3000實时荧光定量PCR仪和Realtime PCR Master Mix试剂盒对样品进行实时荧光定量PCR检测，每个样品重复测定3次。PCR反应体系：2Realtime PCR Master Mix 10.0 μL，10.0 μmol/L定量上、下游引物各0.8 μL，10.0 μmol/L TaqMan探针0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，RNase-free ddH2O 6.0 μL。扩增程序：95 预变性10 min；95 15 s，61 60 s，进行40个循环。 1. 6 统计分析 仪器自动根据MC3R、β-actin基因标准品拷贝数的对数（以4为底）和阈值循环数（Ct）制作定量标准曲线，并拟合回归方程。再根据回归方程与样品检测得到的Ct，计算出待测样品中的基因拷贝数。各样品的MC3R基因转录水平是由MC3R基因的拷贝数除以β-actin基因的拷贝数计算得出，并利用SPSS 19.0软件方差分析品种间或组织间的差异显著性。方差不齐时，需先用平方根反正弦再开方（sin-1 ）1/2对数据进行转换。 2 结果与分析 2. 1 标准品定量扩增产物的电泳结果 MC3R、β-actin基因定量标准品扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果与预期结果相符（图1）。 2. 2 TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线 MC3R基因的TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线回归方程为y=-0.2845x+20.971，R2=0.9955（图2）。β-actin基因的TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线回归方程为y=-0.371x+17.109，R2=0.9967（图3）。 2. 3 MC3R基因转录水平 根据上述双标准曲线，分别求出各样品中MC3R和β-actin基因转录拷贝数，以β-actin基因为内参，计算出山羊个体MC3R基因的转录水平，每个品种4个个体转录平均值即为该品种该组织的平均转录水平（表2）。5个山羊品种在组织中MC3R基因转录水平分析结果显示，在心脏、肝脏、肺脏、肾脏、背最长肌、半膜肌、皮下脂肪中均有MC3R基因转录，但转录水平存在差异。组织间比较结果显示，MC3R基因在皮下脂肪、肾脏、肝脏高度转录，在肺脏中度转录，但在心脏、背最长肌、半膜肌中的转录水平较低。品种间比较结果显示，在心脏、肝脏、肺脏、肾脏、背最长肌、半膜肌和皮下脂肪中，MC3R基因转录水平均以贵州白山羊最高，显著高于其他品种（P0.05）。 3 讨论 基因转录是实现从DNA到蛋白质的重要环节，是遗传型到表现型的重要过渡，研究基因的组织表达对了解基因的表达规律、蛋白质的分泌部位及可能的功能位点具有重要意义。在某些特殊情况下（如蛋白含量低、功能活性不明显、抗体获得困难、假基因等），从mRNA水平检测基因表达比从蛋白质水平检测更方便、灵敏。本研究所检测5个山羊品种的心脏、肝脏等7个组织器官均有MC3R基因转录生成，与已有研究结果相似。如Rpselli-Rehfuss等（1993）认为，MC3R基因在外周组织中转录生成mRNA。Chhajlani等（1993）和Tao（2010）研究发现，MC3R基因在中枢神经系统的大部分区域和一些边缘组织包括胃肠道和胎盘中均转录。Abbott等（2000）研究表明，MC3R基因主要在下丘脑、丘脑、海马、胎盘、小肠、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、肾和心脏等组织中转录。Abdel-Malek（2001）研究发现，MC3R基因主要在下丘脑、丘脑、海马、前杏仁核、皮质、胎盘、胃、十二指肠、胰脏中转录。冯力等（2009）研究发现，MC3R基因在脂肪组织、心脏、骨骼肌等组织中转录。MC3R基因在山羊的多种组织中转录，从转录水平说明山羊体内MC3R的作用靶组织广泛。 本研究结果显示，MC3R基因在皮下脂肪、肾脏、肝脏中的转录水平高于心脏、背最长肌、半膜肌等肌肉组织，与何夏萍等（2013）研究发现性成熟长白猪的MC3R基因在大脑和脾脏高转录，在垂体、肺脏和肾脏低转录，在肌肉中检测不到其转录的结果相似。不同组织器官中，不但MC3R基因转录水平不同，而且MC3R基因的主要功能作用也不同。谢建中等（2010）研究表明，在犬的下丘脑内尤其在下丘脑腹内侧核、弓状核和脊髓等部位，MC3R基因高转录，其主要功能是调节能量平衡；在心脏、肠、胎盘、巨噬细胞等外周组织细胞，MC3R基因也有转录，但其主要功能是维持体重稳态，也调控某些炎性因子的分泌；张冬杰和刘娣（2012）研究发现，民猪腿肌内MC3R基因在低温冷诱导后转录明显上升，据此推测民猪是通过上调MC3R基因的转录来增加能量消耗而抵御寒冷气候。因此，在研究MC3R基因转录水平与体重、能量平衡等生长性状和肉质性状的关联性时，应考虑实验取材部位对MC3R基因转录水平差异的影响。 本研究结果还显示，MC3R基因在同一组织的转录水平存在品种间差异，贵州白山羊显著高于其他品种。本课题组的前期研究（杨家大等，2015）结果表明，在黔东南小香羊、贵州白山羊、贵州黑山羊、黔北麻羊和南江黄羊的肾脏、心脏、肺脏、背最长肌、半膜肌、皮下脂肪中，Leptin及MC4R基因的转录水平均以贵州白山羊最高，与本研究结果一致。MC3R、MC4R与Leptin的主要生物学功能十分相似，均具有调控摄食、能量平衡和体重的功能（Hoggard et al.，2004；戴汉川和龙良启，2005；张轶博等，2005；苏毅，2006）。Leptin是上游信号分子，MC3R和MC4R则是Leptin通路中的下游分子，也是Leptin受体的下游信号，Leptin信号通过MC3R、MC4R分子介导传递，最终调控动物的采食量、采食频率和体重等（Benoit e