southernDIG试剂盒说明书(CSPD)翻译版.doc

来自于丁香园论坛！由丁香客freshman0316 上传！只用于生命科学研究，不能用于诊断程序仅用于体外实验DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit 采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用CSPD化学发光检测，随时即用。货号：11 585 614 910此试剂盒储存条件：-15到-25。此试剂盒可对10ng-3gDNA进行12次标记反应，可检测1010cm2面积的杂交膜24张。指导手册2005.12 版1 前言1.1 内容表1 前言1.1 内容表1.2 试剂盒成分2.介绍2.1 产品简介3. 操作步骤和所需材料3.1 在你开始前3.2 流程图3.3 地高辛标记DNA3.4 标记效率的确定3.5 DNA的转移和固定3.6 杂交3.7 免疫检测3.8 DNA印记的洗脱和再杂交4. 附录4.1 故障排除4.2 参考文献4.3 订购信息1.2 试剂盒的成分瓶号标记内容包括功能1DIG-高效引物50L 地高辛标记的高效引物5浓度的标记混合物：优化的浓度的随机引物，核苷酸，地高辛标记的dUTP（碱标记的），Klenow酶和缓冲液成分随时可用澄清的粘液用于DNA的高效随机引物标记2DIG标记的对照DNA20L5g/mL 质粒pBR328 DNA （用Bam HI线性化）澄清溶液用于确定标记效率3DNA稀释缓冲液3管1mL50g/mL鱼精DNA,10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH8.0 在25澄清溶液4抗地高辛的碱性磷酸酶结合物50L750U/mL从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶澄清溶液5CSPD随时可用50mL CSPD澄清溶液6封闭液4100mL10浓度黄色，粘液7地高辛杂交颗粒100mL地高辛杂交液共4瓶，用于DNA杂交附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。在每个操作程序的前面提供了详细的信息。操作程序仪器设备试剂3.3 DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水0.2M pH8.0 灭菌的EDTA3.4 标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜*地高辛洗涤和封阻缓冲组合*或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.5 DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备20SSC或者10SSC3.6 杂交尼龙膜，带正电荷*杂交袋*，或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。3.7 免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶杂交袋*地高辛洗涤和封阻缓冲液组合*，或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液3.8 DNA 斑点的脱色和重新标记探针大的托盘水浴10SSC10%SDS0.2M NaOH *标记的产品可以从Roche Applied Science 获得。2.介绍2.1 产品概况实验原则此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroid hapten去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测1,2,3。步骤描述DNA 标记根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛标记的DNA探针。地高辛标记的高效引物是一种专门生产的反应混合物，其中含有地高辛dUTP,碱性标记（图1）和所有的试剂，包括随机引物标记所必须的酶，已预先混合优化的5浓度反应缓冲液。杂交根据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP能够更加容易和有效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交。免疫检测杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测，Fab段，然后采用即时可用的化学发光底物CSPD可以看到杂交结果。采用碱性磷酸酶可以对CSPD进行，酶的脱磷酸化，导致在最大波长477nm处有光的发射（图2），这一现象可以用适合的图像仪或者X光片进行记录。胶片的曝光时间范围只在5-30分钟内。图1 DIG-dUTP ，碱性标记图2 CSPD反应应用地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物体也可以进行检测，如人，大麦和小麦。样品材料至少100bp的DNA片段线性的质粒，cos质粒或者DNA超螺旋的DNA实验时间 此表格列出了每一步实验所需的反应时间。步骤反应时间DNA标记1小时-过夜杂交 6小时或者过夜免疫检测1.5小时化学荧光信号检测5-30分钟检测数量一个试剂盒足够用于:12个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3g；并可以检测24张1010cm2的杂交膜。质量控制根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA pBR328进行标记，并按照下面的标准检测操作方法在点杂交中用50ng的异源的DNA稀释0.1pg 同源DNA,用即时可用的CSPD，X光片曝光30分钟进行检测。试剂盒的储存和稳定性未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15到-25（保质期印在标签上）。在干冰中运输。一旦开封，请根据下表选择适宜的储存条件。试剂盒成分储存条件抗地高辛碱性磷酸酶结合物（4号管）2-8稳定。注意：不要冻存CSPD随时即用(5号管)2-8，避光保存。封阻液（6号管）未开封时 15-25 稳定。一旦开封，应分装并储存在-15到-25或者无菌条件下2-8间可以稳定保存1个月。工作溶液都应是新鲜配制的。地高辛杂交颗粒储存在15-25一旦开封，无菌条件下溶液可以稳定存在1个月。地高辛高效引物混合物保质期12个月，-15到-25。避免反复冻融。灵敏度和特异性采用southern杂交从0.3g人胎盘 DNA（经Bgl 或EcoR酶切）中检测到单拷贝基因（组织纤溶酶原激活因子tPA）。优点此表描述了这个试剂盒的优点和特征优点特征精确、快速预先已混好的地高辛高效引物混合物减少了标记DNA 时手动操作的时间，同时提高了产量，重复性好灵敏在复杂的总人DNA及植物基因组中能够检测到单拷贝基因。省时地高辛标记的探针可以至少储存一年。杂交溶液可以重复利用3-5次，重复次数主要取决于每次杂交中产生信号的标记探针的量。3 实验步骤和所需材料3.1 在你开始前主要的操作要求此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示：要求指引在清洁的条件下进行操作高压灭菌地高辛系统的试剂过滤灭菌的溶液包括：SDS,吐温20，并应该加入到已灭菌的溶液中。用干净的孵育托盘每次使用前都要严格地清洗实验托盘处理膜的要求带无粉手套处理膜的时候，只能够用干净的镊子夹膜的边缘3.2 流程图3.3部分地高辛标记DNA3.4部分标记效率的检测3.5部分DNA固定3.6部分杂交3.7部分免疫检测3.8部分洗脱和DNA斑点与另一探针的杂交3.3 地高辛标记DNA介绍随机引物标记的DNA带有地高辛-11-dUTP,这一标记采用的是地高辛高效引物试剂，这是一种含有随机六碳糖，dNTP混合物的5浓度标记混合物，其中dNTP混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP，标记级的Klenow酶和适合的反应缓冲液。附加设备和所需试剂水浴冰水混合物此表中列出了成分，储存条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途。溶液成分储存条件/稳定性用途水高压灭菌的双蒸水15-25，稳定稀释DNAEDTA(乙二胺四乙酸)0.2M EDTA,pH 8.015-25，稳定终止标记反应模板DNA下表中列出了模板DNA所需特征： 特征详细信息纯度模板DNA应该采用the High Pure Plasmid Isolation Kit进行制备。当采用其他商业化的纯化试剂盒进行纯化时，我们建议额外进行一次苯酚/氯仿抽提以去除残余的蛋白质。在标记之前如果对模板进行限制酶切或者其他酶的修饰作用，那么此步骤也是需要进行的。大小为了获得理想的结果，模板DNA应该线性化，且大小应该在100bp以上。如果模板DNA大于5kb，那么在标记之前应该采用限制性酶切序列为4个核苷酸的限制性酶（如Hae ）对模板进行酶解。数量上面步骤描述原则上10ng-3g的模板均可以标记上，然而请仔细查看在给定的表中，用于你的杂交实验所需的探针。可以根据提供的操作方法放大总体积和成分用量来获得更大量的标记探针。如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因，需标记的模板DNA用量至少300ng（探针浓度：25ng/mL 杂交液）。标记从琼脂糖凝胶上分离的DNA如果你想要完成基因组的southern 杂交，你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板DNA从载体上分离出来。 为了从凝胶中分离DNA,你可以用琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒(the Agarose Gel DNA Extraction Kit)进行大小在400bp-5kbp范围内DNA片段的回收。 这一试剂盒既可以用于标准琼脂糖凝胶也可用于低熔点琼脂糖凝胶。然后，不需要进一步纯化即可对DNA片段进行高效的地高辛标记。然后标记好的探针应该用高效的PCR产物纯化试剂盒（High Pure PCR Product Purification Kit）进行纯化，以去除残留的琼脂糖颗粒。步骤此步骤用于标记10ng-3g DNA 。可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的DNA（最高达10g）。步骤操作1向一个反应管仲中加入1g模板DNA（线性或超螺旋）和高压灭菌的双蒸水，终体积达16L。2沸水浴10分钟以变性DNA，然后迅速插入冰水混合物中。注意：完全变性对于标记的有效性是十分重要的。3充分混合DIG-High Prime(1号管)，并取4L加入到变性DNA中，混合并简单离心。37孵育1小时或者过夜。注意：较长的孵育时间（最高达20小时）能够提高地高辛标记DNA的产量（见下表）4加入2L 0.2M EDTA(pH8.0) 和/或 65加热10分钟终止反应。注意：采用地高辛高效引物获得的地高辛标记片段的长度范围可以从200bp到1000bp甚至更长，这主要取决于原始模板DNA的长度。标记反应的产量表1：此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。在标准反应中每个实验采用1g DNA 作为模板。1小时内，大约有15%的核苷酸参与到了0.8g新合成的地高辛标记DNA中。20小时后消耗了大约38%的核苷酸。模板DNA1h20h 10 ng45 ng600 ng30 ng130 ng1050 ng100 ng270 ng1500 ng300 ng450 ng2000 ng1000 ng850 ng2300 ng3000 ng1350 ng2650 ng使用DIG-High-Prime溶液，增加不同模板DNA的量进行反应，并检测反应1小时和反应20小时的差异。地高辛标记DNA的产量由放射线示踪器进行测定，并通过斑点杂交进行证实 （10个独立标记实验的平均值）。图3 来自于不同量模板DNA的地高辛标记DNA在37孵育1小时和20小时后的产量3.4 标记效率的确定介绍地高辛标记DNA产量的确定对于获得最佳的，具有可重现性的杂交结果十分重要。在杂交混合物中探针浓度过高容易产生背景，而太低浓度则容易导致信号弱。实验原则检测标记探针质量的好方法是直接检测法。步骤描述1将地高辛标记DNA的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上。尼龙膜部分区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记的对照DNA（2号管）作为标准。2采用anti-DIG-AP结合物(4号管)和随时即用的CSPD对尼龙膜进行免疫检测。采用适合的图像仪或者X光片曝光的方法比较地高辛标记DNA与对照DNA的一系列稀释点的强度。所需附加溶液的制备请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液无DNA酶和RNA酶系列产品中获得。请注意：标记效率确定实验中检测部分所需的试剂和工作试剂应与你的杂交实验（请看3.7章）中化学发光检测使用的试剂一致。这些试剂可以大量制备，在第3.7章中也将用到。溶液成分/制备储存/稳定性用途洗涤缓冲液0.1M马来酸0.15M NaClpH 7.5(20)0.3% (v/v)Tween 2015-25,稳定去除未结合的抗体马来酸缓冲液0.1M马来酸0.15M NaCl用NaOH(固体)调节pH值到7.5(20)15-25,稳定封阻液的稀释检测缓冲液0.1M Tris-HCl0.1M NaClpH 9.5(20)15-25,稳定调整pH值到9.5试剂盒工作溶液的制备 下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：溶液成分/制备方法储存/稳定性用途封阻溶液用马来酸缓冲液按照1：10的比例将10封阻液（6号管）稀释成1工作溶液一直新鲜制备封阻膜上非特异结合位点抗体溶液每次使用前将原始管仲的anti-digoxigenin-AP(4号管)10000rpm离心5分钟。然后从表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1：10000（75mU/mL）的比例稀释anti-digoxigenin-AP2-8，12h与地高辛标记的探针结合稀释系列根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释，标记的探针和地高辛标记的对照DNA（2号管）应该稀释到1ng/L。利用第3.3章中图表可以最好的估计出在你的探针中地高辛标记DNA的预期产量。产量取决于起始时的模板量和孵育时间。注意：表1中给出的产量是采用高纯度的DNA模板在最佳条件下生产出的。按照下表中的描述对你标记的探针和你的对照DNA进行一系列的梯度稀释。管DNA(L)来自于管#DNA 稀释缓冲液（3号管）(L)稀释比例终浓度1稀释的原液1ng/L2514951：10010pg/L3152351：3.33pg/L452451：101pg/L553451：100.3 pg/L654451：100.1 pg/L755451：100.03 pg/L856451：100.01 pg/L90-50-0操作步骤下面的步骤描述的是直接检测。注意：在全部的步骤中，用足够的缓冲液体积完全覆盖膜。步骤操作1分别从你标记的探针和标记对照DNA的2-9号管中取出1 L点在尼龙膜上2通过紫外交联或者120烘烤30分钟的方法将核酸固定在膜上3将膜转移到一个装有20mL 马来酸缓冲液的塑料容器中在15-25中振荡孵育2分钟4在10mL 封阻液中孵育30分钟5在10mL 抗体溶液中孵育30分钟6用10mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15分钟7在10mL检测缓冲液中平衡2-5分钟8将膜上带有DNA的一面朝上，放在一个折叠夹上（或者杂交袋），向膜上加入0.1mL的随时即用的CSPD(即从5号管中滴4滴)。立即折叠夹的另一面盖到膜上，均匀的铺平底物，且膜上不能有气泡。15-25中孵育5分钟9除去多余的液体，将折叠夹的边缘都封好注意：在暴露过程中膜干了会导致黑背景的产生。10在15-25中，采用图像仪曝光大约5-20分钟，或者用X光片曝光15-25分钟。注意：化学发光持续至少48小时。在检测反应开始后的几个小时里信号是不断增强的，将达到一个阈值，这时的信号强度几乎可以持续到接下来的24-48小时。很多曝光都可以在此理想的信号强度下完成多。结果分析比较对照与你的标记反应产生的点的强度差异，并计算出地高辛标记DNA的量。如果你的探针稀释后量达0.1pg的点与对照DNA的点均可见，那么说明标记的探针达到了预期的标记效率（见第3.3章中表1），能够满足杂交所需的探针浓度。3.5 DNA的转移和固定转移方法和膜凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中Sambrook等的文章。胶中不加入EB会更好，因为EB可能引起背景不均匀的问题。所有普通类型的DNA转移方法都适用于后续的地高辛杂交实验（7，8）在你们的实验中，用20SSC采用毛细管转印的方法就爱那个DNA转印到带有正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。注意：碱性转移（如在0.4M NaOH中）不适用于地高辛标记分子量marker的转移。固定操作将DNA固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：如果你想采用那么紫外交联的方法（尼龙膜）将膜放到已经用10SSC 浸透的Whatman 3MM滤纸上。洗涤之前次啊用紫外交联这块湿润的膜紫外交联后，将膜放入双蒸水中简单冲洗一下，然后自然晾干。120，烘烤（尼龙膜）在2SSC简单的洗涤一下膜将尼龙膜放在120下烘烤30分钟或者根据操作说明的要求进行操作。80，烘烤（尼龙膜）在2SSC简单的洗涤一下膜将尼龙膜放在80下真空烘烤2小时膜的储存请根据下表选择膜的储存方法。如果那么你想继续实验立即将这个膜进行预杂交如果你想稍后进行实验那么将干燥的膜储存于2-83.6杂交需要的附加设备 冰水浴 震荡水浴 或杂交炉 耐高温的塑料或者玻璃盒，培养皿，滚筒瓶或者可密封的塑料袋注意：不要用敞口的容器盛放杂交缓冲液杂交工作溶液的制备 分两次小心的将64mL无菌双蒸水加入到地高辛杂交颗粒瓶（7号瓶）中，然后立即在37条件下搅拌5分钟进行溶解。杂交温度 适宜的杂交温度是根据GC含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得的，具体的公式如下： Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I) I=能够杂交上的片段的长度，以碱基对进行计算 Topt.= Tm -（2025） 这一给出数字的方程式是根据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。用于地高辛杂交液进行杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm低20-25。Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有18%的错配。当你的探针与靶序列的相似度低于80%时，你应该相应的降低Topt（大约每1%的错配要降低1.4），同时相应的调整严谨洗涤步骤（即提高SSC浓度和降低洗涤温度）。操作步骤 请参照下表进行实验。步骤操作1将适量体积的杂交缓冲液提前预热到杂交温度（37-42）。在适当的容器中温和振荡30分钟进行预杂交。注意：膜应该自由的移动。尤其是如果你在同一个预杂交溶液中放入几张膜。2变性地高辛标记的DNA探针（在地高辛杂交液中浓度大约为25ng/mL）是将探针放入沸水浴中煮5分钟后快速放入冰水混合物中冷却。注意：因为DIG-11-dUTP 是碱标记的，因此DNA 探针不能用碱处理（NaOH）的方法变性。3将变性的地高辛标记探针加入到预热的地高辛杂交缓冲液（每100cm2 的膜加入3.5mL杂交缓冲液）中，充分混合但要避免产生泡沫（气泡容易产生背景）4倒出预杂交液，向膜上加入探针杂交液的混合物。温和振荡孵育4小时或延长孵育至过夜。杂交液的储存含有地高辛标记探针的地高辛杂交液可以储存在-15到-25，可以反复使用几次，在每次使用前需要68新鲜变性10分钟。注意：不可以将杂交液煮沸。严谨洗涤对于大部分DNA:DNA应用,用0.5SSC进行严谨洗涤已经足够。针对每个探针来说，正确的洗涤条件应该依据经验来确定。对于人基因组DNA，采用的条件是0.5SSC，65。探针长度大于150bp且GC含量高时，应在68下进行洗涤。对于长度为100bp或更短的探针，洗涤温度应该降低。此表描述了怎样完成后面的杂交洗涤。步骤操作1用足够的2SSC 0.5%SDS连续振荡洗涤两次，每次5分钟。265-68，用足够的0.5SSC 0.5%SDS（提前预热到洗涤温度）连续振荡洗涤两次，每次5分钟。3.7 免疫检测需要附加的试剂 请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液无DNA酶和RNA酶系列产品中获得。溶液成分/制备储存/稳定性用途洗涤缓冲液0.1M马来酸0.15M NaClpH 7.5(20)0.3% (v/v)Tween 2015-25,稳定膜的洗涤马来酸缓冲液0.1M马来酸0.15M NaCl用NaOH(固体)调节pH值到7.5(20)15-25,稳定封阻液的稀释检测缓冲液0.1M Tris-HCl0.1M NaClpH 9.5(20)15-25,稳定碱性磷酸酶的缓冲液试剂盒工作溶液的制备下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：溶液成分/制备方法储存/稳定性用途封阻溶液用马来酸缓冲液按照1：10的比例将10封阻液（6号管）稀释成1工作溶液一直新鲜制备封阻膜上非特异结合位点抗体溶液每次使用前将原始管仲的anti-digoxigenin-AP(4号管)10000rpm离心5分钟。然后从表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1：10000（75mU/mL）的比例稀释anti-digoxigenin-AP2-8，12h与地高辛标记的探针结合操作步骤此表描述了完成一张100cm2膜的免疫检测方法。注意：所有的孵育均是在15-25下，振荡完成的。如果膜还需要再次与探针杂交，那么任何时候都不要让膜干。步骤操作1杂交和严谨洗涤后，将膜简单的用洗涤缓冲液冲洗1-5分钟2在100mL 封阻液中孵育30分钟3在20mL 抗体溶液中孵育30分钟4用100mL洗涤缓冲液洗涤两次，每次15分钟5在20mL检测缓冲液中平衡2-5分钟6将膜上带有DNA的一面朝上，放在一个折叠夹上（或者杂交袋），向膜上加入1mL的随时即用的CSPD(5号管)。立即折叠夹的另一面盖到膜上，均匀的铺平底物，且膜上不能有气泡。15-25中孵育5分钟7除去多余的液体，将折叠夹的边缘都封好注意：在暴露过程中膜干了会导致黑背景的产生。8将潮湿的膜放在37条件下孵育增加向X光片曝光前的前孵育时间，持续时间大于30分钟，最长可延长至12小时10分钟，以增强发光反应。9在15-25条件下，采用图像仪曝光大约5-20分钟，或者用X光片曝光15-25分钟。注意：化学发光持续至少48小时。在检测反应开始后的几个小时里信号是不断增强的，将达到一个阈值，这时的信号强度几乎可以持续到接下来的24-48小时。很多曝光都可以在此理想的信号强度下完成多。3.8 DNA印记的洗脱和再次探针杂交主要信息 印记中的碱性标记形式的DIG-11-dUTP 能够更容易更有效的被洗脱，以用于再一次的杂交实验。所需附加的仪器和试剂 大烧杯 水浴 10SSC 10% SDS 0.2N NaOH操作步骤 此操作描述的是膜的洗脱。 注意：如果计划印记需要洗脱和再次杂交，那么膜在任何时候都不能干。可