抗真菌药物敏感试验.ppt

抗真菌药物敏感试验,沈 永 年,概 述,真菌感染的发病率,尤其是深部真菌感染的发病率逐渐增高 大量新型抗真菌药物不断涌现 临床耐药菌株的出现 抗真菌药物敏感实验为临床耐药菌株的发现，抗真菌药物的选择提供指导。,概 述,抗真菌药物敏感实验方法是建立在抗细菌药物敏感实验方法基础之上 由于真菌是一种高等的生物，其繁殖方式、生长周期、生长条件等均与细菌不同，因此抗真菌药物敏感试验一直是国内外学者研究的难题。因此，实验方法多样化，但尚无通用的标准方法。 美国国家临床试验标准委员会（NCCLS）从1992年起，制订了一系列针对抗真菌药物敏感实验的指导性文件，但目前仍不能适用于所有医学真菌的检测。,抗真菌药敏试验目的,指导抗真菌药物的选择 测定抗真菌药物对致病真菌的敏感性，提供临床用药量及预后监测的参考 筛选耐药菌株及研制对致病真菌有效的抗真菌药物提供临床应用,常见术语,最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC） MIC50，MIC90，MIC5080 最低杀菌浓度（minimal fungicidal concentration MFC） MFC50，MFC90 最低有效浓度（minimal effective concentration，MEC ）,抗真菌药敏试验方法,药基法 琼脂稀释法 试管（液体）稀释法 微量液体稀释法 菌基法（琼脂扩散法） ROSCO抗真菌药敏纸片法 E试验法（Etest）,酵母样真菌药物敏感试验,酵母菌液基稀释法抗真菌药物敏感试验于1992年由美国国家临床试验标准化委员会（NCCLS）提出标准实验方案（M27P）以来，几经修订，目前已由M27A2取代。此外，其他药物敏感试验方法如琼脂稀释法，琼脂扩散法，E试验法等时有应用。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),药液的制备 储存液：浓度至少为1280g/mL或10倍于受试的最高浓度。储存液浓度需根据药物本身溶解性决定。 氟康唑和5氟胞嘧啶（5FC）以灭菌蒸馏水溶解；酮康唑、伊曲康唑、两性霉素B、伏力康唑等采用DMSO溶解。 储存液分装后置60 保存。解冻后的储存液应在24h内使用，不得重复冻存使用。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),药液的制备 使用液： 水溶性药物以无菌蒸馏水将储存液倍比稀释至工作液浓度（10倍测试浓度）。 非水溶性药物则需将储存液用DMSO倍比稀释至100倍测试浓度，再采用无菌蒸馏水稀释至工作液浓度（10倍测试浓度），以防止药物的析出。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),培养基的制备 2倍浓度RPMI 1640培养基（不含NaHCO3）作为标准培养基，用0.33mol/L MOPS缓冲液溶解,调节pH值至6.97.1（室温），过滤除菌，4可保存4周。在培养基中加入4%葡萄糖可促进菌生长，帮助终点的判断。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),菌液的制备 受试菌在SDA或PDA中35 培养24小时（念珠菌属）或48小时（新生隐球菌）。 取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒，采用分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个麦氏单位浊度，相当于11065106/mL，作为菌液的贮备液。 使用时，采用2倍量培养基将菌液调整至工作浓度为1.01035.0103/mL。再用无菌蒸馏水倍比稀释成0.51032. 5103/mL。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),实验步骤： 取无菌的15mm100mm试管进行实验 在试管中依次加入0.1mL倍比稀释的不同浓度药物工作液。 依次在试管中加入0.9mL菌工作液，混匀。注意整个过程需在15min内完成。 实验过程中，设置空白对照和生长对照。同时进行质控菌株平行试验，进行质量控制。 将试管置于35 培养4650h观察结果。对于新生隐球菌，培养时间应延长至7074h。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),结果判读 两性霉素B 终点的判断比较容易，无肉眼可见生长的最低药物浓度为两性霉素B的MIC值。 氟胞嘧啶及唑类 往往在最低浓度时也可出现轻度浑浊。此时，可取生长对照管中菌悬液0.2mL，加入培养基0.8mL混匀作为判断终点的浊度（即80菌的生长受到抑制时的浊度)，与此浊度相近的试管即可判定为终点，其药物浓度为该药的MIC值。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),结果的判定 新三唑类药物 酵母菌的MIC值为0.0316 g/mL，大多数酵母菌的MIC值小于1 g/mL。目前尚无资料说明MIC值与临床疗效之间的关系。 氟胞嘧啶、氟康唑和伊曲康唑 判定标准如下表所示。氟康唑的判定标准不适用于克柔念珠菌。采用不适当的溶媒溶解伊曲康唑可导致结果偏差。,念珠菌体外药物敏感试验的结果判定标准,注：如果测定的MIC值位于上述分类之间，则将该菌划分入 高一级类别中,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),注意事项 测试药物的浓度范围应包括终点浓度和质控株的MIC范围。一般常见药物的测试浓度范围： 两性霉素B 0.031316g/mL； 氟胞嘧啶0.12564 g/mL ； 酮康唑0.031316 g/mL； 伊曲康唑0.031316 g/mL； 氟康唑0.12564 g/mL， 新三唑类药物（如伏力康唑等）0.031316 g/mL。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),注意事项 测试过程中，需进行生长空白对照、空白对照、质控菌株对照。 应选择对抗真菌药物无拮抗作用的缓冲液溶解RPMI 1640培养基，如MOPS。Tris缓冲液、PBS缓冲液因可与药物存在相互作用而不适用。 培养基pH值可能影响测试结果，应严格控制pH值于6.97.1。,微量液体稀释法,药液（储备液和工作液）的制备 储备液的制备同试管稀释法。与试管稀释法不同，微量稀释法的工作液浓度是测试浓度的两倍。 培养基的制备：同试管稀释法 菌液（储备液和工作液）的制备 菌储备液的制备同试管稀释法，但工作液浓度稀释调整至两倍测试浓度（即11035103/mL）即可，不需再用无菌蒸馏水倍比稀释。,微量液体稀释法,试验步骤 1. 药敏板的制备：采用96孔U型板，每排110孔依次加入不同浓度待测药物工作液100 l，第1孔为最高浓度，第10孔为最低浓度。制备好的药敏板可用塑料薄膜包裹后置70保存6月以上。 2. 取制备好的药敏板，在110孔加入100l菌工作液，第11孔中加入100l无菌蒸馏水和100l菌工作液，作为生长对照；12孔仅加入无菌不含药物培养基作阴性对照。 3. 将培养板置于35 孵育48小时(新生隐球菌为72小时）后读取结果。,微量液体稀释法,结果判读 观察前，可轻轻震摇药敏板，使终点判读更容易。如果出现菌膜沉淀，须进行吹打、涡旋或其他方法混匀后，在进行结果判读。 结果判读以生长对照孔作为标准，将生长情况进行评分： 0：完全透明清澈； 1：轻度浑浊 2：浊度较生长对照明显下降； 3：浊度较生长对照轻度下降； 4：浊度与生长对照一致。,微量液体稀释法,结果判读 两性霉素B： 以评分为0的最低药物浓度 为MIC值 5FC和唑类： 评分为2的最低药物浓度作为MIC值。通过分光光度计检测显示，此时大约50菌生长受到抑制。 结果判读可缩短至24小时，只要第11孔有菌生长即可进行，对结果无明显影响。,琼脂稀释法,将琼脂平板中掺入不同浓度的抗真菌药物，以多点接种法将待测真菌接种于琼脂表面（各点所种真菌量相同），以菌不生长的最低药物浓度定为该药对真菌的MIC。 优点：可同时测定多个菌株，易于确定终点。比液体稀释法重复性好。 缺点：方法繁琐，耗时长。,琼脂稀释法,药液的制备： 同试管液基稀释法，工作液浓度为10倍浓度的测试浓度，各种常用药物的浓度测试范围为： 两性霉素B 0.031316g/mL； 氟胞嘧啶0.12564g/mL 酮康唑0.031316g/mL ； 伊曲康唑0.031316g/mL 氟康唑0.12564g/mL ； 新三唑类药物（如伏力康唑等）0.031316g/mL。,琼脂稀释法,培养基制备 RPMI 1640培养基: 2倍量:RPMI 1640 20.8g,葡萄糖40g, 以0.33M MOPS缓冲液溶解,调整pH值至6.97.1,过滤除菌,置-20保存。 HR培养基： 2倍量：29.3g HR培养基，NaHCO3 2.0g，溶于1000mL双蒸水中，调整pH值至7.5，过滤除菌，低温保存。 4琼脂： 40g 琼脂，溶于1000mL蒸馏水中，高压灭菌15min，备用。,琼脂稀释法,菌液的制备 受试菌在SDA中35 培养24小时（念珠菌属）或48小时（新生隐球菌） 取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒，采用分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个麦氏单位浊度，相当于11065106/mL，作为菌液的工作液。,琼脂稀释法,药物平板的制备 将RPMI 1640培养基或HR培养基置60预温。 取4琼脂，加热融化后，置60，保温。 将培养基和琼脂1:1混匀，分装入试管中，每管分装13.5mL，仍置60保温。 将不同浓度药液（工作液）1.5mL加入试管中，轻轻震摇混匀，倒入平皿，置水平桌面使之凝固，注意混匀时避免出现气泡。37， 15分钟，使干燥。 如采用平板多点接种，可将培养基18mL，加入不同浓度药液2mL，混匀倒入9cm直径平皿，制成药物平板备用。,琼脂稀释法,接种和培养 在药物平板中接种测试菌液，每点接种15l，可进行多点接种。并设置生长对照平皿，空白对照平皿和标准菌株对照。 37 培养48h或72h（新生隐球菌） 终点判定：确定生长对照菌生长良好，空白对照无污染菌生长。逐一观察从高浓度至低浓度平皿上的生长情况，以菌不生长平皿的药物浓度作为对该菌的MIC值。,琼脂扩散法,将待检菌掺入琼脂培养基内，将浸有固定浓度的抗真菌药液纸片置于琼脂培养基表面，经孵育后，根据纸片周围真菌生长被抑制的范围大小确定药物对真菌的抑制作用。如同时应用系列浓度纸片，尚可测出MIC值。 优点：简单、易行、不需复杂设备 缺点：单一浓度纸片仅能定性，不能确定MIC值。 药物纸片的标准化问题。,琼脂扩散法,培养基制备 基本培养基为MH琼脂，其中加入2%葡萄糖和亚甲基兰（0.5g/mL）。调整pH值至7.27.4（室温下）。高压灭菌后分装入平皿，室温下冷却凝固后，37温箱中干燥1030min，以去除平皿表面水蒸气。 培养基平皿可在28 冰箱保存一周。如采用塑料袋包裹可适当延长。 使用前，应抽取同一批次平皿置于3035孵箱中24小时，以确定无污染。,琼脂扩散法,药液纸片制备： 商品化药液纸片：应保存于14以下冰箱中。使用前，应提前取出置于室温中平衡12小时。,琼脂扩散法,菌液制备 同试管稀释法，受试菌在SDA或PDA中35 培养24小时（念珠菌属）。 取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒，采用分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个浊度单位，相当于11065106/mL，作为菌液的贮备液。,琼脂扩散法,操作步骤： 用棉签蘸取菌液涂于平板上，重复三次，每次将平板旋转60o再进行涂布，最后涂布平板边缘。 将浸有药液的纸片贴于琼脂表面，可轻微加压保证纸片与琼脂贴合紧密。纸片与纸片中心距离一般大于24mm。通常，150mm平板纸片数量不超过12个；100mm平板不超过5个。由于药物扩散在接触时即已进行，因此，当纸片接触平板后即不可再移动。 将贴有纸片的平皿翻转后置35培养2024小时，观察结果。如24小时菌生长不良，可将培养时间延长至48小时。,琼脂扩散法,结果判读 药物对受试菌有生长抑制时，可围绕纸片形成抑制环。以明显受抑制的环边缘作为边界，测量抑制环大小。环边缘针尖大小菌落或环内的大菌落可忽略不计。,琼脂扩散法,结果判定 质控菌株的参考值（mm）,琼脂扩散法,结果判定：,念珠菌氟康唑琼脂扩散法（25g纸片）结果与MIC值对照,抗真菌药敏纸片法,丹麦ROSCO公司从20世纪70年代开始研制抗真菌药敏纸片，操作简单，结果直观，易于普及，只要严格按照ROSCO公司NeoSensitab抗真菌药敏纸片方法操作，可与NCCLSM27p有很好的符合率。主要适用于酵母样真菌的药敏试验。该方法也是一种琼脂扩散法。,抗真菌药敏纸片法,培养基 采用SHADOMY琼脂，用磷酸盐缓冲液调节pH至7.0，同时添加氯霉素控制细菌污染。培养基高压灭菌后，倒入9cm培养皿中制成平板备用。,ROSCO抗真菌药敏纸片分类合名称,抗真菌药敏纸片法,菌液制备及操作步骤 取沙堡琼脂上30培养48小时的待测酵母样菌半白金耳，磨种至生理盐水中，充分震荡后调整接种液菌浓度至5105/mL，相当于0.5麦氏浊度单位。 将菌液按前述方法用棉拭子涂布于培养基平板上，35培养1824小时，观察结果。隐球酵母属真菌，30 ， 4248小时判读结果。,基本判读标准（局部治疗用）,严重系统性感染株判读标准,酵母纸片药敏的质控 （0.5麦氏浊度，1：1稀释，培养1824h）,E试验法,琼脂扩散法的改良，将原单一药物浓度纸片用含有梯度浓度排列的药液条代替，通过形成的椭圆形抑菌圈，可判断药物的MIC值。本法与琼脂稀释法比较，二者的符合率为95，在提高试验的敏感度及减少实验步骤等方面有较大的优越性。,E试验法,培养基：RPMI 1640或HR培养基，含2琼脂和2葡萄糖，制备过程同琼脂扩散法，调节pH值至7.0, 倒入平皿，冷却凝固，制成培养基平板。 菌液：制备同琼脂扩散法，调节菌液浓度至0.5麦氏浊度单位。 E试验纸片：有商品提供。纸片上含有梯度浓度排列的药物。,E试验法,操作步骤 1. 用棉拭子蘸取菌液涂布于培养基平板 2. 将含不同药物的E试验药液塑料条贴于培养基上，150mm 平皿最多贴45个；90mm平皿最多贴12个。 3. 35培养24小时（念珠菌）或48小时（隐球菌属）后判读 结果。,E试验法,结果判读 可见到呈椭圆形的抑菌圈，圈边缘所指示的相应位置的数值（药物浓度）即为MIC值。,丝状真菌（双相真菌） 药物敏感试验,由于丝状真菌生长较慢，体积较大，给丝状真菌的药物敏感试验带来很多困难。目前，丝状真菌的药物敏感试验无论是在培养基的选择、菌量的确定或终点判断上均无标准化的方法。因此，至今尚无重复性好、简单易行、被广泛接受的标准化试验。一般常用的方法包括琼脂稀释法，液体微量稀释法等。,琼脂稀释法,培养基制备 沙氏琼脂：葡萄糖20g，蛋白胨10g，琼脂20g，溶于1000mL蒸馏水，调整pH至6.8，高压灭菌。 CAS培养基：Casitone 9g，酵母浸膏5g，枸橼酸三钠10g，磷酸氢二钠1g，磷酸二氢钠1g，葡萄糖10g，琼脂20g，溶于1000mL蒸馏水，高压灭菌。,琼脂稀释法,菌液制备 1. 将待测菌株接种于PDA上，28培养7 10天 2. 取约5mg菌量，置于生理盐水中，Potter研磨器研碎，经四层无菌纱布过滤，以血细胞计数板计数分生孢子或碎菌丝成分，以灭菌生理盐水调节分生孢子或菌丝成分至103/mL。,琼脂稀释法,药物工作液的制备 参考酵母样菌试管液基稀释法的药液配制。药物工作液浓度是测试浓度的10倍。,琼脂稀释法,药物培养基制备 1. 以不同浓度的药物2mL加至18mL经56融化的琼脂中使之混匀，每个 浓度药立即分别倒入直径9cm的培养皿中，待琼脂固化后，4 冰箱中 保存。也可采用试管法，即不同浓度药物0.3mL，加入2.7mL培养基， 倒入无菌试管制成斜面备用。 2. 培养基中的药物最终浓度为： 两性霉素B 0.0364g/mL 唑类药物0.125128 g/mL 特比萘芬0.03128 g/mL 阿莫罗芬0.01100 g/mL,琼脂稀释法,操作步骤 1. 取不同菌液以多点接种法接种入培养基，每点为15l 菌液。 2. 28，培养37天。 3. 培养期间，每24小时读结果1次，以肉眼判定无菌生长 的最低药物培养皿的浓度为MIC。,微量液体稀释法,培养基制备 同酵母样菌试管液基稀释法，采用含0.33M MOPS的RPMI 1640培养基，pH6.97.1 药液制备：同酵母样菌试管液基稀释法， 储存液浓度至少为1280g/mL。工作液浓度为2倍测试浓度。,微量液体稀释法,菌液制备 1. 受试菌株在PDA上35培养7天，促进小分生孢子生成（镰刀菌属先在35培养4872小时，然后2528培养至7天）。 2. 1mL无菌生理盐水冲洗菌落，曲霉菌落可在无菌生理盐水中加入1滴吐温20。 3. 收集冲洗液，静置35分钟，取上部较均匀混悬液，涡旋混匀，分光光度计测定OD值。曲霉和申克孢子丝菌调整OD值至0.090.11; 根霉、镰刀菌及波氏假阿什利菌调整至0.150.17。 4. 将上述悬液用培养基进行1:50稀释，即得到工作液（2倍最终浓度），约为0.41045104cfu/mL。,微量液体稀释法,试验步骤 1. 采用96孔U型板，每排110孔依次加入不同浓度待测药物工作液100 l ，第1孔为最高浓度，第10孔为最低浓度。 2. 在110孔加入100l菌工作液，第11孔中加入100 l无菌不含药物的培养基和100 l菌工作液，作为生长对照；12孔仅加入无菌不含药物培养基作阴性对照。 3. 培养板置于35孵育。根霉在培养2126小时后，镰刀菌、曲霉和孢子丝菌在4650小时，波氏假阿什利菌7074小时后读取结果。,微量液体稀释法,结果判读 结果判读以生长对照孔作为标准，将生长情况进行评分。 0：完全透明清澈或无生长； 1：少量生长，大致相当于生长对照孔的25 2：生长明显减少，相当于生长对照孔50 3：生长轻度减少，相当于生长对照孔75 4：无明显生长抑制，与生长对照一致,微量液体稀释法,结果判读 1. 两性霉素B 终点易判断，以评分为0的最低浓度为MIC 2. 氟胞嘧啶和唑类药物 以评分为2的最低浓度作为MIC 3. 伊曲康唑及其他三唑类 一般终点容易判断，以评分为0的最低浓度作为MIC。如出现终点判断困难，提示该菌在临床中可能耐药。,微量液体稀释法,结果判定：目前MIC与菌株耐药情况的关系尚不清楚。 1. 两性霉素B：多数条件致病丝状菌