薄层色谱法.ppt

1,薄层色谱法,2,又称层析法，是一种依据物质的性质（溶解性、极性、离子交换能力、分子大小等）的不同，当流动相携带样品流经固定相时，样品各组分在两相中不断的重新分配，最终达到分离与提纯，以便于对样品进行定性和定量分析的分析方法。,色谱法,3,（一）概述 （二）固定相和展开剂,薄层色谱法 （thin layer chromatography; TLC),（三）薄层色谱法的基本技术,（四）薄层色谱法的应用,4,薄层色谱法 （thin layer chromatography; TLC),（一）概述 1.背景 1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。 因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。 70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。,5,薄层色谱法（TLC),2.方法原理(图示) 薄层色谱分离法是将固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制成薄层板，试样中的各组分在固定相和作为展开剂的流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。不同物质上升的距离不一样而形成相互分开的斑点从而达到分离。,6,薄层色谱法（TLC),7,薄层色谱法（TLC),比移值Rf,Rf1ac Rf2bc,溶剂前沿,8,薄层色谱法（TLC),比移值(Rf) Rf = 0 表明该组分不被展开剂所溶解，仍停留在原点。 Rf = 1表明该组分不被固定相吸附，而随流动相同速度移动。 Rf的合适范围为 :0.2Rf 0.8,9,薄层色谱法（TLC),3. 特点 （1）设备简单，操作方便。 （2）快速，展开的时间短。 （3）适于分析小量样品(一般几到几十微克)，也适于大量样品的分离（可以分离出几毫克甚至几十毫克组分）。,10,薄层色谱法（TLC),（二）固定相和展开剂 . 固定相选择 柱色谱中所用的吸附剂 要求吸附剂的粒度更小。商品吸附剂区分为色谱级（用于柱色谱）和薄层色谱级（用于薄层色谱）。,11,薄层色谱法（TLC),. 常用的固定相 （1）硅胶：微酸性极性固定相，适用于酸性、中性物质分离。 （2）氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱性、中性物质分离 。 （3）聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适用于酚类、醇类化合物的分离。 （4）纤维素：含有羟基的极性固定相，适用于分离亲水性物质。,12,薄层色谱法（TLC),.展开剂选择： 薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，一般根据“相似相溶”的原理。更多地采用试验的方法，在一块薄层板上进行试验。 当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。,13,薄层色谱法（TLC),板的制备 点样 展开 显色 定性定量分析,（三）薄层色谱法的基本技术,14,薄层色谱法（TLC),制板（以硅胶板为例） 选择合适的玻璃板，依次用水和乙醇洗净，晾干。取适量薄层色谱用的硅胶，加适量蒸馏水调成糊。调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。将硅胶倒在玻璃板上，摇动摊平，晾干。使用前放入烘箱内，在105-115oC左右烘干40-50分钟。冷却后使用。,15,薄层色谱法（TLC),点样 将试样用最少量展开剂溶解，用毛细管蘸取试样溶液，在薄层板上点样。在样点上轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细线。薄层色谱板载样量有限，勿使点样量过多。,16,点样方法： 注：动作要轻， 毛细管或点样器不能混用， 斑点大小适当，可多次点样。,平头50ul微量点样器,全自动点样仪,点样基线：距底边2.0cm 样点直径：2-4mm 点间距离：1.5-2.0cm,17,薄层色谱法（TLC),展开 吹干样点，竖直放入盛有展开剂的有盖展开瓶中。展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点。 盖上盖子，展开。待展开剂上行到一定时间（由试验确定适当的展开高度），取出薄层板，标记展开剂的前沿线。,18,展开方式：上行展开,过程：预饱和（滤纸贴于展开槽内侧）、展开、标记溶剂前沿,薄层色谱法（TLC),19,薄层色谱法（TLC),展开方式：下行展开,20,展开方式 多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以75 为最佳。展开距离一般为10-15cm。 多次展开一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。 分步展开混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。,薄层色谱法（TLC),21,展开方式 连续展开使到达薄层上缘的溶剂不断蒸发，连续展开以增加展开距离。 二维展开在两个垂直的方向上进行展开。,薄层色谱法（TLC),22,色谱槽需密闭良好，防止边缘效应,薄层色谱法（TLC),展开:注意事项,23,展开时的注意事项,边缘效应：用混合溶剂展开时，同一组分的斑点在薄层中部比在边缘移动速度要慢的现象。,24,产生原因：展开槽未被展开剂饱和。尤其是使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，Rf相对增大。同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比边缘的Rf值小，即边缘效应。,展开时的注意事项,25,消除办法：若在展开前先将展开槽与薄层板用展开剂蒸气饱和后再展开，边缘效应可消失。采用双槽层析缸进行预吸附。,展开时的注意事项,26,薄层色谱法（TLC),显色，计算Rf值 选择合适的显色方法显色。量出展开剂和各组分的移动距离，计算各组分的比移值。 紫外光显色：不破坏组分结构 碘蒸气法：碘是一种简便、灵敏非破坏性和可逆的通用显色剂。 化学显色：不可逆的化学反应。 如：氨基酸 + 茚三酮 = 蓝紫色化合物,27,紫外灯观察,喷显色剂观察,薄层色谱法（TLC),28,薄层色谱法（TLC),（5）定性分析：Rf,29,展开后，薄层分离所得斑点中化合物可进一步定量，其测定方法可分为两大类： 一类为洗脱测定法，将所需测定的斑点中的组分用适当溶剂洗脱，再选用适当方法定量； 另一类为直接测定法，色谱分离后，直接用肉眼观察比较或用仪器扫描斑点而测定其含量。,薄层色谱法（TLC),（5）定量分析,30,定量分析：洗脱测定法,1 斑点的定位 2 斑点的洗脱:用吸集器将斑点位置的吸附剂吸下，然后用洗脱溶剂洗脱。 3 测定 (1)紫外分光光度法：洗脱液调整至一定体积，在此化合物最大吸收波长处测定。同时把样品斑点相应位置薄层吸附剂同样取下做空白对照。 (2)比色法：选择灵敏度高、专属性好的比色反应测定化合物含量，是比较常用的方法。 (3)其它方法：极谱、库仑滴定、荧光测定等。,薄层色谱法（TLC),31,定量分析：直接测定法,1 目测法 样品经色谱分离后，直接观察所得斑点的大小和颜色的深浅，并与标准品在相同条件下展开所得到的一系列已知不同浓度的标准斑点相比较，而近似地判断样品中所测成分的含量。 2 仪器测定法,薄层色谱法（TLC),32,判断依据：Rf值,查找资料：影响Rf值的因素 吸附剂种类、活度、颗粒大小；展开剂纯度和极性；薄层厚度；点样量；展开方式、温湿度；展开槽中的预饱和状态等。 对照品比较法：常用。,1、定性鉴别,（四）薄层色谱法的应用范围,薄层色谱法（TLC),33,对照品比较法：,杂质对照品制成一定浓度的溶液,样品制成一定浓度溶液,按相同的点样量点样,展开后观察斑点颜色深浅和大小,2、杂质检查（杂质限量检查）,薄层色谱法（TLC),（四）薄层色谱法的应用范围,34,如异烟肼中游离肼的检查： 肼是一种诱变剂和致癌物质，中国药典对异烟肼原料和注射用异烟肼中游离肼的检查均采用薄层色谱法。 检查方法 取本品，加水制成每1ml中含50mg的溶液，作为供试品溶液。另取硫酸肼加水制成每1ml中含0.20mg（相当于游离肼50g）的溶液，作为对照溶液。吸取供试液10l 与对照溶液2l，分别点于同一硅胶薄层板（用羧甲基纤维素钠溶液制备）上，以异丙醇丙酮（3:2）为展开剂，展开后，晾干，喷以乙醇制对二甲氨基苯甲醛试液，15min后检视，在供试品主斑点前方与硫酸肼斑点相应的位置上，不得显黄色斑点。,薄层色谱法（TLC)：例子,对照品比较法：,35,薄层色谱法（TLC),（四）薄层色谱法的应用范围,对照品比较法,异烟肼中游离肼的检查：,观察在供试品溶液主斑点前方与对照品溶液主斑点相应位置，是否显示鲜黄色斑点。可知异烟肼片中游离肼的含量是否低于药典规定的限量。,2、杂质检查（杂质限量检查）,36,自身稀释对比法（杂质结构不明或无杂质对照品）,主成分溶液稀释制成一定浓度的溶液,样品制成一定浓度溶液,按相同的点样量点样,展开后观察斑点颜色深浅和大小,薄层色谱法（TLC),（四）薄层色谱法的应用范围,2、杂质检查（杂质限量检查）,37,如地西泮中有关物质的检查： 取本品的细粉适量（约相当于地西泮200mg），加丙酮5ml,振摇，使地西泮溶解，滤过，取滤液作为供试品溶液；精密量取适量，加丙酮稀释成每1ml中含地西泮0.20mg的溶液，作为对照溶液。点样展开后，供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深。,薄层色谱法（TLC)：例子,自身稀释对比法（杂质结构不明或无杂质对照品）,38,目视比较法,对照品制成不同浓度的系列溶液,样品制成定量溶液,按相同的点样量点样,展开后观察斑点颜色深浅和大小,注：本法适用于近似含量的测定，误差10%,3、含量测定,薄层色谱法（TLC),（四）薄层色谱法的应用范围,39,仪器测定法,（1）吸收测定法 展开后的薄层，用一定波长单色光束进行扫描，记录其吸光度的变化，得到扫描曲线。 利用样品扫描曲线上峰高或面积与标准品相比较，可得出样品含量。 （2）荧光测定法 化合物本身有荧光或经过适当处理后生成荧光化合物者可测量其荧光强度而进行定量。,用薄层扫描仪（TLC Scanner）扫描定量，该方法已成为薄层定量的主要方法。,薄层色谱法（TLC),40,薄层扫描仪对色谱斑点进行扫描,用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点的扫描，用仪器测量通过斑点或被斑点反射的光束强度的变化从而达到定量的目的。,41,吸收测定法的分类,根据对光测定方式的不同，可分为两种： 透射法 反射法,透射法扫描 反射法扫描 L 光源；MC 单色器；P 薄层板； S 斑点； PD 光电检测器,42,薄层色谱法在各个学科中的应用,食品和营养 药物和药物代谢 化学和化工 医学和临床 毒物分析和法医化学 农药,43,取本品水蜜丸6g，研碎，或取小蜜丸或大蜜丸9g，切碎，加硅藻土4g，研匀。加乙醚40ml，低温回流1小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮1ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹皮酚对照品，加丙酮制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录 B)试验，吸取上述两种溶液各10l,分别点于同一硅胶薄层板上，以环己烷醋酸乙酯(3:1) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性 5三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝褐色斑点。 （2005年版中国药典一部 401页）,一、六味地黄丸中丹皮酚的薄层鉴别,薄层色谱法（TLC)应用实例,44,1.丹皮酚； 25.六味地黄丸,六味地黄丸中牡丹皮的薄层图谱,45,二、醋酸可的松中其他甾体的检查,取本品，加氯仿-甲醇(91) 制成每1ml 中含10mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量醋酸可的松，加氯仿-甲醇(91) 稀释成每1ml 中含0.10mg的溶液，作为对照溶液。照薄层色谱法（附录 B）试验，吸取上述两种溶液各5l，分别点于同一硅胶薄层板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(38560152) 为展开剂，展开后，晾干，在105 干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视。供试品溶液如显杂质斑点，不得多于3 个，其颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深。,薄层色谱法（TLC)应用实例,46,三、硫酸长春碱中杂质的限量检查,中国药典(2005年版)规定硫酸长春碱中其他生物碱的检查方法如下：取本品，加甲醇制成10mg/ml溶液作为供试溶液。精密吸取适量加甲醇制成0.02mg/ml溶液作为对照液。取上述两溶液各5l点于同一硅胶GF254薄板上，展开，检识；供试溶液中的杂质斑点不得超过两个，且颜色不得深于对照溶液主斑点的颜色。,薄层色谱法（TLC)应用实例,47,A.会使点样里的组份分不开 B.可能会淹没所划出来的细线,从而溶解所 点的样 C.展开剂会