再谈病理石蜡切片制片规范的重要性.doc

再谈病理石蜡切片制片规范的重要性【关键词】 规范操作；石蜡切片；HE染色 摘 要 为了规范病理石蜡切片制片，减少漏、误诊的发生，提高病理诊断的准确性，本文对病理技术操作规范化的重要性及石蜡切片、HE染色的细节之处做了探讨。较详细的介绍了切片方法，影响因素。关键词 规范操作；石蜡切片；HE染色在病理技术领域，这是一个谈了几十年的话题，一张良好的HE染色切片，是病理诊断、教学和科研中一项不可缺少的环节。几十年来病理技术有了较大的发展，新设备的问世使病理技术工作者大大减少了烦琐的手工操作，新技术的应用充实了病理诊断的方法，提高了诊断的准确性。尽管如此，最常规、最基础、最重要的仍然是石蜡切片、HE染色。因为它的质量与病理诊断的准确性相关。规范操做是保证石蜡切片、HE染色质量的前提，下面笔者就其几大步骤结合自己的多年经验谈谈此操作规范的重要性。1 甲级组织脱水、石蜡切片、HE染色的标准1.1 组织脱水后包埋优质蜡块的标准 无凹陷和浑浊。组织无斜坡和缺损。无白点和气泡。1.2 优质切片的标准 切片薄厚适度、无缺损。无褶皱，无刀痕，无裂纹，不掉片。捞片位正，无气泡。1.3 优质HE染色片的标准 着色适中，色泽鲜艳。清晰透彻，染色质呈颗粒状。切片无污染，封片无溢胶，无气泡。标签清晰，位正，编号准确。2 优质HE染色的关键步骤2.1 组织固定 新鲜的组织经过适当的固定才能保持细胞和组织的固有形态。否则由于细胞内含有各种酶，当细胞缺氧时酶将细胞内的蛋白质分解破坏导致组织自溶。因此，手术切除的组织标本一定要及时固定。病理科应主动与临床科室联系，强调组织固定的重要性沟通方法及要求。病理科收到较大标本后，应急时按1 cm2 cm刀距切开，用流水洗去组织表面的黏液及血液，然后投入有足量的10甲醛容器中。用于组织固定的液体很多，各种固定液均有其各自的优点，但最常用的就是甲醛了。它固定效果好，即适合普通HE染色，又能满足免疫组化和特染的需要。但市售甲醛通常浓度不足且偏酸，因此，使用时要酌情增加甲醛原液的量并调整其至pH=7.0左右。2.2 组织脱水和透明 一般组织内含有大量水分，而石蜡不溶于水，所以在进行石蜡包埋前，必须脱去组织内的所有水分，组织经脱水后，又由于酒精不是石蜡的溶剂，所以组织在浸蜡前还要一种媒剂的参与。二甲苯既溶于酒精又溶于石蜡还能使组织透明，它也是检验组织脱水是否彻底的一种手段，脱水不好透明度则不能达标。因此，一定按时更换脱水剂及透明剂。2.3 组织的浸蜡和包埋 切片石蜡要求质地纯净，软硬适中(选蜡要依季节和地域的温差而酌情)。组织浸蜡一般以二缸或三缸依次进行为好，浸蜡不充分或蜡温不得当，均影响染色质量。包埋和浸蜡时所用蜡的熔点要一致。镊子的温度要稍高于蜡温，夹取组织块，将切面向下，平放于包埋框内，并用镊尖轻轻压平。囊壁、管腔组织应竖直包埋，胃镜等小块组织应尽量聚在一起，并保证在一个平面上。2.4 石蜡切片、展片及附贴2.4.1 切片前要校正切片机的厚度标尺及切片刀的角度(一般厚度3 m4 m，角度2030)，切片刀必须锋利无缺口，修整蜡块，暴露组织全貌，修整过的组块不要冻的过硬，否则切片时易出现碎沫，特别是淋巴组织、甲状腺等。较难切的部分放在上面，如：皮肤的表皮，肿块的包膜等，这样可以减少组织的断裂现象。对脱钙组织及已知钙化组织，一定选用固定刀口，以保证切片刀其他部位的锋利，然后用力均匀地做连续切片。好刀可以弥补前序的不足。2.4.2 展片、附贴(捞片)：展片水温要适中，这主要和包埋蜡熔点有关，水温过高，会引起组织细胞散开，水温过低，切片皱褶无法撑开。包埋蜡中如有二甲苯，展片时会造成蜡溶解现象。展片水中，加少许酒精，以增加其表面张力。轻轻将切片摊于水面，切片即行展开，如有少许褶皱，用镊子轻轻撑开，选其中完好、薄而无皱的一片，持清洁后的载玻片，用镊子将切片引向玻片适当位置，捞取切片。将切片置于60 温箱，烤片40 min。烤片温度过高，时间过长，会引起细胞收缩，反之容易掉片。由于脑和骨组织较易掉片，最好使用防脱片胶处理过的载玻片。2.5 染色 一组良好的染色试剂决定着染色效果。脱蜡、浸水、脱水、透明用的酒精、二甲苯一定要及时更新，否则影响染片质量。另外，重要的是苏木素和伊红的配制，尤其是苏木素的配制技术要求较高。2.5.1 苏木素的配制 配方：苏木素3 g、无水酒精30 ml、铵明矾或钾明矾60 g、蒸馏水600 ml、氯化汞0.5 g(放置时间较长有氧化时可酌情加量)；配制方法：先将苏木素溶于酒精，另将铵明矾或钾明矾加温、溶于蒸馏水于烧瓶中，全部溶解后，加入苏木素酒精溶液，混合均匀，以强火迅速煮沸，离火加氧化汞，溶液迅速变成紫红色，移烧瓶于冷水中，使之停止氧化。用前过滤。2.5.2 染色步骤 略。2.5.3 染色原理及注意事项 石蜡切片烤干后进入二甲苯以脱去切片中的石蜡，然后，各级酒精清洗切片中的二甲苯，同时使切片浸水，渐进于苏木素的染色环境。苏木素染细胞核之前须用蒸馏水清洗切片，以保护其性能。细胞核染色的时间应视苏木素染液的着色能力而做调整。用1盐酸酒精分化，脱去片内无用的苏木素，保证细胞核染色清晰。染色和分化的时间要灵活掌握，二者是一个有机配合的过程，固要求更新苏木素染液时应以单片试验，调整好二者的时间，确认调试准确后再行批量染色。3 讨论以上就优质蜡块、优质切片、优质染片，这三大步骤的规范提出了要求。那么，我们就要严格的按照操作规范去做，以达到制片全过程的优质标准。老病理技术员都有体会，一张优质的HE染片全程，是一环套一环的。任何一个环节不按规范去操作，最终都会影响染片的质量。取材组织脱水不好，包埋后的组织块易出现凹陷和白点，切不出完整的片子，有缺损的片子必然影响诊断。包埋时镊子加温过高，易烤焦镊子夹取处的组织，影响染色。烤片时间过短，容易掉片；时间过长，细胞核染色发灰而不透亮。脱蜡、脱苯、染色、脱水、透明某一步做的不好，都直接影响下一步的质量。脱蜡、脱苯不彻底，组织浸水就不充分，苏木素着色不尽意，脱水不染片则不透明，镜下呈“雾里看花”，影响诊断。那么怎样才能克服工作中这些诸多的不足呢?规范化操作是克服这些毛病的良药。我们要把一张清晰透亮，镜下细胞浆与细胞核红蓝相映，新鲜透亮，对比鲜明，核膜及核染色质颗粒清晰的切片，牢牢的印在脑子里，时刻以它为标准，严格自己的操作规范。常常提醒自己：我是按规范操做的吗?时间一长，习惯自然形成。一个良好的工作习惯是病理技术人员必不可少的。组织脱水、石蜡切片和HE染色，前辈和诸多的教课书均有论述。笔者认为：欲制作出优质蜡块、优质切片、优质HE染片，首先要以认真、严谨的工作态度和一丝不苟的责任心为前提，更要严格操作规范。虚心向前辈学习，互相交流，结