种子萌发试验操作规程.doc

种子萌发试验操作规程种子和幼苗是植物一生最脆弱而又最关键的阶段,它们经历着较高的死亡风险(Hammond&Brown,1995),面临着不可预测、多变的环境。在这样的选择压力下，不同植物有着不同的生活史对策，最大目的是在有利的条件下增加幼体数量，同时减少不利条件下个体死亡风险。种子的萌发能力影响着幼苗存活、个体适合度及植物生活史的表达。因此，种子萌发时的抗性已成为植物抗逆生理的重要研究课题。1. 种子基本信息记录试验种子名称、产地、种子数量、采集人等基本信息，根据种子数量合理安排后续试验内容。2. 种子基本形状的观测（根据试验要求选取）：2.1种子大小测定20粒种子的长度和直径，取平均值。2.2千粒重以1 000粒3组的平均值为其平均千粒重(标准误差)。2.3种子形态观察3. 种子萌发试验程序：3.1萌发预试验选取少量种子进行萌发试验，检测种子是否存在休眠。3.2打破种子休眠试验根据种子基本形状及采集生境确定可能的休眠原因，设计打破休眠的方法，并检测效果。3.2.1生理休眠及其打破方法这类种子具有通透性种皮和充分发育的胚，但缺乏足够的生长势去克服胚包围物的机械阻力。有三个水平：非深休眠、中等休眠、深休眠。一些非深休眠的种子可采用热和冷层积处理可以破除休眠。这种休眠种子较多，比例大。具有生理休眠的盐生植物主要分布在以下科中：番杏科、苋科、芸薹属、石竹科、藜科、莎草科、大戟科、禾本科和玄参科。这些植物多半生长在盐沼、盐荒漠、峭壁和沙丘地区。3.2.2形态休眠及其打破方法这类种子胚发育不充分。在种子萌发前将这些种子放在一定的水分及适宜的光、暗和湿度条件下，它们的胚可以继续生长，生长到一定水平后可以萌发。具有形态休眠的盐生植物主要分布在以下科中：石蒜科、伞形科、五加科、槟榔属、田基麻科、百合科和罂粟科。3.2.3形态生理休眠及其打破方法这类种子是形态休眠和生理休眠相结合类型的种子。胚发育不充分而且在生理上也是休眠的。必须经受温和（或）冷的层积处理才能萌发。石蒜科、伞形科、五加科、槟榔科、田基麻科、百合科和罂粟科中部分盐生植物的种子属于这类。3.2.4环境休眠及其打破方法一些种子种皮阻止吸水导致不萌发。漆树科、木槿科、旋花科、锦葵科、无患子科和椴树科中某些植物种子属于此类。3.2.5解除休眠方法汇总冷层积和温层积处理照光和黑暗处理温周期处理激素处理其他方法：如针刺、机械摩擦3.3种子萌发试验步骤种子的萌发实验以每50粒为一组，3次重复。将种子放入铺有2层滤纸、直径为9 cm的培养皿中，滴3 mL左右蒸馏水将种子浸湿，在培养箱内进行萌发试验。以5/25、12 h光周期进行变温培养(模拟所研究生境的春季气温和日照条件)。每24 h进行萌发检测、统计萌发个数，以肉眼看到白色的幼根为标准判断种子是否萌发。在需要时加入少许蒸馏水，以保证种子有充足的水分供应。萌发实验持续40 d，对没有萌发的种子用TTC法进行种子活性检测。萌发实验后的种子有萌发、休眠和死亡3类，最终萌发率为种子萌发总数占所测种子中有活性种子的比率。4. 种子萌发条件试验（可根据种子数量调整因素梯度）：4.1种子萌发预实验取10粒饱满种子，在一定温度（25）下进行发芽试验，观测是否存在休眠。4.2 温度和光照的影响4.2.1 在恒温下的萌发如果种子量足够，可设置5、10、15、20、25、30等恒定温度下，分别在持续光照，持续黑暗或日/夜变换光照下(光照10 h，黑暗14 h)萌发。4.2.2 在日/夜变换温度下萌发在光照条件不变情况下，萌发温度随日/夜而变换(10 h / 14 h):25/5, 25/10, 25/15, 25/20, 30/5, 30/10, 30/15, 30/20, 30/25。4.2.3 种子在持续光照、暗中的萌发将种子在适宜的温度(如25)下，分别放在持续光照下(100EM-2S-1)或暗中进行萌发试验。5. 种子耐盐性试验（可根据种子数量调整因素梯度）：设置不同梯度盐浓度，如NaCl溶液浓度0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mmol/L。分别挑取50 粒籽粒饱满的种子，均匀摆放在铺有两层滤纸的 9 cm 培养皿中，每皿加 NaCl 溶液 5 ml，每两天更换一次盐溶液。NaCl 溶液浓度为：0、50、100、200、400、800 mM，以胚根露出种皮作为萌发标准，每天固定时间记录萌发数。20天后，将未萌发种子转至上述无盐营养液中，记录 10 天的萌发恢复数。30 天总萌发率=(ab)/c100%，a 为盐处理 20 天的萌发数，b 为盐处理后未萌发种子转至无盐营养液 10天的恢复萌发数，c 为每皿种子数 50 粒。上述培养皿放于 25恒温黑暗培养箱中，每处理3 次重复。6. 种子耐旱性试验（可根据种子数量调整因素梯度）：利用等渗的聚乙二醇（PEG）模拟设置不同干旱梯度，如PEG-6000浓度分别为:0、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10%、20%、30%、40%【对应的渗透压根据Michel和Kaufmann文献中PEG溶液浓度与渗透势的关系方程，计算公式如下: s=-(1.1810-2)C-(1.1810-4)C2+(2.6710-4)CT+(8.3910-7)C2T。式中，s是溶液的渗透势(bar)，1 bar = 0.1 Mpa；C是PEG-6000溶液的浓度(g/kg H2O)；T是溶液的温度()。】,将所选种子用0.1%HgCl2消毒，再用无菌水冲洗后，置于铺有浸透各浓度PEG溶液滤纸的培养皿中，每皿50粒，3次重复，置于室温下培养，每天定时观察并记录发芽种子数。7. 种子耐冷性试验（可根据种子数量调整因素梯度）：可设置5、10、15或变温处理（夜间低温）。8.种子萌发试验可测定指标及其定量标准：8.1发芽：以胚根的出现为标志。8.2发芽率：是指种子在发芽试验初期规定的天数内（初次计数时），正常发芽种子数占供试种子数的百分比。8.3发芽势：是指在发芽过程中日发芽种子数达到最高峰时，发芽的种子数占供测种子数的百分比。8.4发芽指数(Gi)：计算公式为Gi=Gt / Dt。其中，Gt为在时间T时的发芽数，Dt为发芽日数。8.5萌发速率(GR)：GR=(DGS)/NGP10，DGS是日累积萌发数除以相应的萌发天数所得商，N为从萌发开始到结束的天数，GP为最终萌发率(杜国祯和马锦荣，1997)。8.6活力指数(VI)VI =发芽指数(GI)幼苗干重(或苗长)8.7萌发值(germination value，简称GV)GV是Czabator于1962年提出的，其表达式为:GV=PVMDG式中的PV是通过萌发起点外切于累积萌发曲线的切线斜率，也就是日累积萌发幼苗数除以试验时间所得最大值。MDG是平均每天萌发的幼苗数，由此可见GV指数随总发芽率、萌发速度增高而增大，但随萌发历期的延长而减少。Diavanshir等于1976年，提出了GV的改进公式:GV(D)=(DGS)/N(GP10)式中DGS为日累积萌发数除以相应的萌发夭数所得商，N为从萌发开始到结束时的天数，GP为最终发芽率，10完全是为了平衡Gv(D)值而乘的一个数。其值在每日萌发粒数多而萌发历期短，最终萌发率高时增大。事实说明，Gv(D)指数在一定程度上能够较好地反映种子萌发能力，是一较为理想的检验种子萌发能力的指数。但是，其计算公式中用10去乘，这完全是为计算方便，没有理论根据和生物学意义。从这个意义上讲，GV(D)仍然不如GV指数具可用性。8.8萌发抗旱指数(Germination drought resistance index, GDRI) GDRI(%)=(渗透胁迫下的萌发指数100)/对照萌发指数，其中，萌发指数= ( 1.00)nd2+( 0.75)nd 4+( 0.50) nd 6+(0.25)nd8(式中: nd2、nd4、nd6、nd8 分别为第 2、4、6、8 d 的种子发芽率；1.00、0.75、0.50、0.25 分别为相应萌发天数所赋予的抗旱系数。主要参考文献：1 黄振英, 张新时,Yitzchak GUTTERMAN,郑光华. 光照、温度和盐分对梭梭种子萌发的影响J. 植物生理学报,2001, 27(3):275-2802 黄振英, Yitzchak GUTTERMAN,胡正海,张新时 白沙蒿种子萌发特性的研究II.环境因素的影响J. 植物生态学报,2001, 25(2):240-2463 郑光华. 种子生理研究M.北京:科学出版社,2004,:3013954 王桔红, 崔现亮, 陈学林, 杜国祯.中、旱生植物萌发特性及其与种子大小关系的比较J.植物生态学报,2007,31(6)1037-1045. 5 杜国祯, 马锦荣. 十五种野生草本植物种子在不同温度下萌发能力的研究J. 草业学报, 1994,3(1), 18-24. 6 Michel BE, Kaufmann MR. The osmotic potential of polyethylene glycol 6000J. Plant Physiology, 1973,51(5):914-916.7 Hammond DS, BrownVK. Seed size ofwood plants in relation to disturbance, dispersal, soil type in wet Neotropical forestsJ. Ecology,1995,76, 2544-2561. 8 王赞，李源，吴欣明，等 PEG 渗透胁迫下鸭茅种子萌发特性及抗旱性鉴定J. 中国草地学报,2008,30(1): 50-55.9 安永平,强爱玲,张媛媛,张文银,曹桂兰,韩龙植. 渗透胁迫下水稻种子萌发特性及抗旱性鉴定指标研究J.植物遗传资源学报,2006,7(4): 421-426.10 Divanshir K，Pouriek H. Germinationvaluea new formulaJ.Sllvae genetiea,1976,25:79-83.11 Czabator，F.J.，Germination value:an index combining speed and completeness of pine seed germnation.Forest Seienee,1962,8:386-39612 GrossK L, SmithA D. Seed mass and emergence time effects on performance of Panicum dichotomiflorum Michx. across environmentsJ. Oecologia,1991, 87: 270-278.13 MillerT. Effects of emergence time on survival and growth in an early old-field plant community. Oecologia, 19