大鼠急性脊髓损伤后血小板衍化生长因子-B的表达.doc

大鼠急性脊髓损伤后血小板衍化生长因子_B的表达【摘要】 目的：探讨血小板衍化生长因子_B(PDGF_B)在脊髓损伤(SCI)后对脊髓功能恢复的作用。方法：健康雌性SD大鼠48只随机分为免疫组化组(30只)和反转录_聚合酶链反应(RT_PCR)组(18只)。麻醉后，用改制的型纽约大学装置建立大鼠脊髓急性损伤模型。用免疫组化检测急性SCI后不同时段PDGF_B在脊髓中的表达，用RT_PCR检测PDGF_B的mRNA在急性SCI后不同时段表达的变化。结果：PDGF_B蛋白表达：急性SCI后24h，PDGF_B在损伤区周围神经元的表达开始增加(592323)，并于7d后维持在一定水平，14d后PDGF_B阳性细胞数增多，28d达高峰(85001349)，主要表达于坏死区增生的神经胶质细胞。PDGF_B mRNA表达：SCI后1d，PDGF_B mRNA表达降低，3d接近正常，随后略有下降，14d后mRNA表达升高，28d基本回到正常。结论：急性SCI后，PDGF_B对损伤脊髓的功能恢复有重要作用。 【关键词】 血小板衍化生长因子 脊髓损伤 神经营养因子AbstractObjective: To explore the role of platelet derived growth factor_B(PDGF_B)on spinal cord functional reco_very after acute spinal cord injury(SCI)in rats Methods: Forty_eight health SD female rats were randomly assigned into immunohistochemistry group(n=30), RT_PCR group(n=18). After anesthesia, the rat model with acute SCI was established using the modified weight_drop device from New York University. Immunohistochemistry method was used to detect the expression of PDGF_B protein after SCI,and RT_PCR was used to monitor the changes of PDGF_B mRNA. Results： After SCI, the expression of PDGF_B was different from that of control group. One day later, the numbers of PDGF_B positive cells and the PDGF_B mRNA were showed to increase tendentiously. Until 28 days, the numbers of PDGF_B positive cells reached the peak because of proliferative gligcyte Conclusion: After SCI, PDGF_B plays an important role in spinal cord functional recovery after SCI. Key Wordsplatelet derived growth factor; spinal cord injury; neurotrophic factor脊髓损伤(SCI)后的神经元再生修复一直是神经科学领域的前沿课题。在SCI的病理过程中，多种神经营养因子参与其中。血小板衍化生长因子(Platelet_derived growth factor, PDGF)是由多种细胞合成和分泌的，它与神经细胞上的特异性受体(PDG_FR)结合后能促进神经细胞增殖、分化、趋化和预防程序性死亡的作用。PDGF，尤其是PDGF_B及其受体在神经系统中有广泛的表达，与脑部肿瘤、脑血管疾病和脱髓鞘疾病等多种神经系统的疾病发生密切相关1，为进一步了解PDGF_B在中枢神经损伤后及修复中对神经元的保护作用，本研究采用纽约大学(NYU)装置建立大鼠SCI模型，用免疫组化和反转录_聚合酶链反应(RT_PCR)方法，检测大鼠脊髓急性损伤后不同时段PDGF_B表达的变化,观察PDGF_B表达的变化规律，探索对损伤脊髓神经的保护作用及其对损伤脊髓功能恢复的影响。 1 材料与方法 11动物分组健康成年雌性Sprague_Daley(SD)大鼠(南方医科大学动物实验中心提供)48只,体质量160200g,随机分为免疫组化组又分6个小组(n5)：正常对照组、伤后1，3，7，14和28d组和RT_PCR组又分6个小组(n3)：正常对照组、伤后1，3，7，14和28d组。12SCI模型制备与取材大鼠按3mL/kg体质量腹腔注射质量分数01%(30mg/kg)的戊巴比妥钠。术区备皮，体积分数75%的酒精消毒，铺巾。做背部正中切口(T9T11)，钝性分离皮下组织、肌肉，暴露T10棘突。用咬骨钳仔细咬去T10棘突及椎板，充分暴露该段脊髓背面及两侧1。用改制的型NYU装置(撞击高度25mm，撞击针10g，接触面积2mm2)对暴露脊髓的T10节段进行撞击,造成相当于中度SCI程度。撞击成功的标志：大鼠尾巴痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩样扑动，双下肢呈驰缓性瘫痪。术区撒青霉素粉，用周围组织填充椎骨缺损部位，分层缝合。术后皮下注射青霉素10000u，开台灯保暖2。术后1、3、7、14、28d及对照组按05mL/100g体质量腹腔注射01%戊巴比妥钠，深度麻醉。开胸暴露心脏，行左心室_主动脉插管，剪开右心耳，灌注NS200mL，然后灌注预冷的体积分数3%的福尔马林200mL，至动物肢体僵硬。固定2h后，以撞击点为中心，取出损伤部位(节段T9T10)及其近、远端各2个节段的脊髓，测量其左、右横径和前、后径后用体积分数10的福尔马林继续固定24h，重新修整后石蜡包埋切片(约5m)，每隔20张切取1张。 13方法 131动物行为评分 分别于SCI后3、7、14、21、28d对两组进行BBB(Basso, Beattie, Bresnahan locomotor rating scale)评分，检测其术后运动功能的恢复情况1。 132免疫组化 采用链霉素生物素蛋白_过氧化物酶连接法：切片以二甲苯脱蜡10min2次，梯度酒精(100、 90、 85、 75)各洗1min，001mol/LPBS振动漂洗5min，微波抗原修复，入体积分数3的H2O2中处理15min以阻断内源性过氧化物酶，蒸馏水振动漂洗3min3次；然后用正常山羊血清工作液封闭10min；入兔抗大鼠PDGF_B多克隆抗体(1100，武汉博士德公司，中国)4冰箱过夜；生物素化标记山羊抗兔IgG 37孵育15min；卵白素标记的辣根过氧化物酶复合物37孵育15min；各步抗体反应间均用001mol/LPBS漂洗3min3次。新鲜配制的含003H2O2的005DAB显色液显色10min，以001mol/LPBS终止反应；苏木精对比染色，体积分数1的盐酸酒精分化数秒，碳酸锂反蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树脂封固。阴性对照用001/LPBS 代替一抗， 采用上述同样操作， 结果为阴性。在Ni_kon显微镜下对整个脊髓的PDGF_B阳性细胞计数。 133 RT_RCR 术后 1、3、7、14、28d及对照组过量戊巴比妥钠麻醉后迅速取损伤脊髓50100mg，加入1mLTrizol(Invitrogen公司，美国)试剂提取总RNA，采用MBI试剂盒逆转录合成cDNA。PCR反应体系内含cDNA1L，PDGF_B或_action引物20moL，2MasterMix(天为时代公司，中国)125L，用双蒸水补至25L反应体系。PDGF_B引物(267bp)：5TCGCACCAATGCCAACTTCC 3， 5_GCTCGATGCTCCCTGGATGT 3； _action引物(631bp)：5TACAACCTCCTTGCAGCTCC 3, 5GGATCTTCATG_AGGTAGTCAGTC 3。 14 统计学处理各时间点阳性细胞数变化采用SPSS 100 for Windows 软件，数据以s表示，多组均数间比较采用one_way ANOVA行t检验。 2 结果 21SCI后功能恢复BBB联合评分对T10SCI后大鼠后肢功能进行评分，发现后肢功能渐行性恢复(图1)。 22 免疫组化染色观察正常大鼠T10段脊髓灰质中的神经元结构清楚，胞质中尼氏体明显，PDGF_B阳性表达部位位于神经元的胞浆。PDGF_B阳性细胞数在SCI后1d迅速减少(P001)，随后逐渐增多，7d后维持在一定的水平，28d尚未恢复到正常(与正常比P001)，但较14d的阳性细胞数多(P001或P005)(表1，图2，封2)。 表1SCI后T10节段各时间点PDGF_B阳性细胞计数 23 RT_PCRSCI后1d，PDGF_B的mRNA水平显著低于对照组(P005)，随后略有下降，经统计分析，3，7与14d 3个时间点组间比无统计学意义(P005), 28d时达到正常。各时间段PDGF_B RT_PCR电泳图见图3。对照组及各时间段PDGF_B的mRNA相对水平见图4。图3 3 讨论PDGF_B链mRNA普遍表达于中枢神经系统，而PDGF_受体在中枢神经系统的神经元和胶质细胞中也广泛分布。研究发现，神经外科手术后或脑损伤修复过程中，伴随着局部PDGF_B链基团表达量的升高和其受体的上调，PDGF_B链在哺乳动物的神经中得到表达3，其参与胚胎神经元细胞的分裂、增殖和分化，在人脑的发育过程中起相当大的作用4；体外实验证明，PDGF使少突胶质细胞的脂类蛋白和髓鞘基础蛋白增加5，除此之外，PD_GF还维持神经元的活性，并促进轴突的生长6。脑损伤后PDGF_B在损伤周围神经元及巨噬细胞中的免疫活性反应增强7,提示PDGF_B参与神经损伤后的应激性反应，保护濒危神经元。本实验对大鼠SCI后PDGF_B表达状况进行观察，中度SCI后1d，脊髓灰质组织中大量神经元发生变性坏死，PDGF_B阳性细胞急剧减少，阳性细胞以神经元为主，此后随着濒危神经元的恢复阳性细胞逐渐增多，7d时明显增加，14d时略有下降，提示PDGF_B参与了SCI后病理变化的全过程，是机体对损伤产生的一种积极应答。14d后可见胶质细胞明显增多，在胶质瘢痕形成期达到高峰。这与PDGF_B在胶质细胞发育过程中可刺激其增殖和分化相符8，表明PDGF_B参与了胶质细胞活化、增生的病理变化过程，刺激胶质细胞增殖，形成胶质瘢痕。另一方面，胶质细胞表达的PDGF_B还可与濒危神经元上的PDGF_B受体结合而产生神经保护作用，说明SCI后可通过PDGF_B来营养和支持神经细胞。其机制通过抑制N_甲基_D天门冬氨酸(NMDA)受体依赖促毒性的发生、阻断NMDA受体介导的Ca2+过度内流来增强神经元生存能力；同时，PDGF受体的激活减少了其他通道开放的可能性而使NMDA受体长期受到抑制9；通过促进抗氧化酶活性发挥神经保护作用10；通过等电点_3的活化抑制神经细胞凋亡11。【参考文献】 1Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight_drop device versus transactionJ. Experimental Neurology, 1996, 139(6): 244-256.2徐锡金， 朴英杰， 霍霞. 人发角蛋白对脊髓损伤大鼠少突胶质细胞增殖分化效应的影响J. 第一军医大学学报, 2003, 23(6)： 542-545.3Ross R, Raines EW, Bower PDF. The biology of platelet_derived growth factorJ. Cell, 1986, 46: 155