奶粉中阪崎肠杆菌分离株表型特征分类.doc

奶粉中阪崎肠杆菌分离株表型特征分类 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)属于肠杆菌属的1个新种1。本文采用目前应用最广、在微生物鉴定方面得到公认的肠杆菌科细菌生化鉴定试剂(API20E)分析了阪崎肠杆菌的生化反应特性，并利用阴沟肠杆菌噬菌体进行裂解试验测定了阪崎肠杆菌的易感性，对奶粉中18株阪崎肠杆菌分离株和4株美国典型菌种保藏中心(ATCC)参考菌株进行了表型分类。旨在对奶粉中阪崎肠杆菌分离株的表型特征进行分类，以便准确地对其鉴别。现报告如下。1 材料与方法11 材料 (1)标准菌株：阪崎肠杆菌ATCC29544，ATCC29004，ATCC51329，ATCC12868。(2)阪崎肠杆菌分离株：分离自国内市场奶粉抽查样品，共18株。经AP120E和英国荧光快速微生物鉴定药敏分析仪，2种系统对阪崎肠杆菌的鉴定概率()。检验检疫菌种保藏中心(IQCC)10403-1(984，9848)；10403-2(98，9489)；10403-3(984，9995)；10403-4(984，9230)；10403-5(98，9237)；10403-6(98，9935)；10403-7(984，993)；10403-8(984，9796)；10403-9(98，9726)；10403-10(984，9596)；10403-11(98，996)；10403-12(984，9926)；10403-13(98，9926)；10403-14(98，100)；10403-16(984，9951)；10403-17(98，9822)；10403-18(98，9935)；10403-23(98，996)。(3)试剂与培养基：脑心浸液肉汤(BHI)(美国Difico公司)；胰酪胨大豆胨琼脂(TSA)、营养琼脂(北京陆桥公司)；API20E(法国生物梅里埃公司)；阴沟肠杆菌噬菌体(广州虎克生物技术有限公司)。12 方法121 菌株培养 将每株参考菌株和分离菌株分别接种于灭菌BHI肉汤，36培养24h，再接种于TSA斜面，36培养24h，作为储备菌株，试验时从储备菌株用接种环接种于营养琼脂，划线分离37培养24h形成单菌落。122 阪崎肠杆菌的生化特征及噬菌体裂解实验 API20E实验：将试验菌株，按照API20E使用说明进行操作，36培养2224h后，按照说明书滴加相关试剂，观察和记录结果。噬菌体裂解实验：接种针轻点生长于营养琼脂上的单个纯菌落，通过管壁研磨使其均匀分散在2ml普通肉汤中，约100CFUml，取1接种环(约100l)菌悬液涂布于经过预处理(90mm，20ml，放4244恒温箱30min使表面干燥)的营养琼脂表面，干燥(同前)，取100l阴沟肠杆菌噬菌体滴加于营养琼脂表面，36培养2224h，观察裂解结果，以融合裂解、不完全裂解和不裂解记录实验结果。123 阪崎肠杆菌的表型特征分类 以ATCC参考菌株在API20E上反应的生化特征为生物1型，对于阪崎肠杆菌分离株，去掉相同的生化反应，保留不一致的生化反应项目进行分析，每1种与参考菌株不同的生化特性为1种新的表型。2 结果21 API20E测定结果 API20E共有21项生化反应，主要区别在于伏-普试验(VP)、肌醇和山梨醇方面，4株ATCC参考菌株生化反应一致，鉴定数值为3305373，7株分离株与参考菌株一致(389)，将参考菌株的表型特征定义为生物1型，按照伯杰氏细菌手册分类方法2，VP、肌醇、山梨醇分别为+、+、-，与生物1型相比，肌醇阴性为3株，比例为167，为生物2型；VP阴性9株，比例为50，为生物3型；山梨醇阳性2株，比例为111，为生物4型；尿素阳性，1株，比例为5，为生物5型；精氨酸阴性1株，比例为5，为生物6型。22 阴沟肠杆菌噬菌体裂解实验 4株ATCC阪崎肠杆菌参考菌株和18株分离菌株经阴沟肠杆菌噬菌体裂解实验，1株分离株被融合裂解，编号为IQCC10403-18，1株为不完全裂解，编号为IQCCl0403-13。3 讨论1999年，Nazarowec-white和Farber对临床和食品中分离到的17株阪崎肠杆菌以及1株ATCC29544进行了表型特征分类3，以ATCC29544参考菌株表型反应作为生物1型，与该生化反应模式比较，山梨醇阳性反应株列为生物2型，VP阴性为生物3型。 本实验采用此方法，对22株(包括4株ATCC参考菌株)进行分析，但实验结果存在差异。首先，ATCC参考菌株反应数值为3305373，而不是3304373，也即差异在VP实验。本实验4株参考菌株VP反应均为阳性，经典考夫曼方法重复实验结果也为阳性，伯杰氏手册中阪崎肠杆菌的VP反应阳性率为90%1002，临床微生物学手册为904。但本实验的分离株VP阳性率为50，这可能与VP实验结果判断临界点有关。本实验之所以进行阴沟肠杆菌噬菌体裂解实验，是因为阪崎肠杆菌在1984年前属于阴沟肠杆菌，包括参考菌株在内的22株菌，有2株分离株能被阴沟肠杆菌噬菌体裂解，这2株均产黄色素，API20E鉴定为阪崎肠杆菌的概率为98，英国先德荧光快速微生物鉴定药敏分析仪鉴定为阪崎肠杆菌的概率>99。此外，还出现尿素反应阳性和精氨酸反应阴性的阪崎肠杆菌菌株，在对阪崎肠杆菌的鉴别中值得注意。【参考文献】 1 Joshua B Gurtler,Jeffrey L Kornacki,Larry R Beuchat.Enterobacter sakazakii:A coliform of increased concern to infant healthJ.International Journal ofFood Microbiology,2005,104(1):1-34.2 李蓉，徐迪诚.微生物分类和鉴定技术进展M.上海：光明日报出版社，1989：39-46.3 M,Nazarowec-white,JM Farber.Phenitypic and genotypic typing of food and c