实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达水平.doc

实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达水平【摘要】 目的 探讨实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达的方法。方法 以BB270femA基因表达为标准，建立实时荧光定量PCR方法，对实验菌株femA表达进行相对定量。结果 建立的实时荧光定量PCR方法所得结果标准曲线线性关系好，熔解峰单一。随MIC变化，金黄色葡萄球菌femA表达水平也随之变化。结论 用实时荧光定量PCR方法研究金黄色葡萄球菌femA表达量结果可靠、敏感、重复性好。 【关键词】 金黄色葡萄球菌；femA基因；实时荧光定量PCR Abstract： Objective To establish the approach of real-time fluorescent quantitative PCR to detect femA gene in Staphylococcus aureus strains. Methods Real-time fluorescent quantitative PCR was performed to quantify the expression of femA gene of 15 clinical stains, as compared with BB270. Results The standard curve by real-time fluorescent quantitative PCR showed good linearity between the amount of femA RNA and cycle threshold and the melting curve had a single peak. The variation of expression level of femA was in accordance with MIC of strains. Conclusions The real-time fluorescent quantitative PCR in the detection of femA expression is accurate, sensitive and repeatable. Key words: Staphylococcus aureus; femA gene; real-time fluorescent quantitative PCR 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，real-time Q-PCR）由于其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点，目前已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域中，其中最主要的应用集中在以下几个方面：DNA或RNA的绝对/相对定量分析，基因表达差异分析，基因分型。 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是全球感染性疾病领域研究热点之一。已知femA是MRSA耐药表达的重要辅助基因，与MRSA高水平耐药成正相关1-3，但还未见研究报道两者确切关系。本实验利用近年来兴起的实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA基因表达水平，进一步明确femA在MRSA耐药表达中的意义。同时建立实时荧光定量PCR用于金黄色葡萄球菌RNA定量检测的具体方法和稳定体系。 1 材料和方法 1.1 菌株和生长条件 我院微生物室从临床送检标本中分离鉴定所得金黄色葡萄球菌，选取MSSA 4株，低耐MRSA 4株，高耐MRSA 7株。1株瑞士捐赠株：BB2701。 上述金黄色葡萄球菌在M-H培养基复苏16 h，挑取菌落置于M-H肉汤中在37震荡培养，测量D600nm，10倍稀释10个浓度，取50 l菌液过夜孵育，选取菌落数在100300之间的稀释倍数计算活菌数。 1.2 最低抑菌浓度（MIC）测定 以琼脂平皿对倍稀释法测定苯唑西林对16株菌的MIC值，以ATCC 25923为质控株，结果判定参照CLSI2006常规标准。 1.3 RNA提取、纯化、逆转录 采用RNA提取纯化试剂盒（上海华舜生物工程有限公司），操作按说明书进行。提取前菌液中加入溶葡萄球菌素（16 U/ml，上海生工生物工程有限公司）。测D260nm以及D260/D280，取D260/D280比值>1.8者继续下一步试验。采用RT-PCR试剂盒（TaKaRa生物工程大连有限公司），操作按照说明书进行。反转录反应：42，15 min，95，2 min。 1.4 real time Q-PCR引物及方案 内参参考文献4-10选用组成型表达基因gyrB，目的、内参基因引物用OLIGO 3.0设计，用BLAST检验引物的特异性，由TaKaRa生物工程（大连）有限公司合成，具体见表1。采用real-time Q-PCR试剂盒SYBR PrimeScript PCR kit for perfect real time，TaKaRa生物工程（大连）有限公司，按说明书进行操作。步骤1预变性95 10 s；步骤2两步法扩增95 5 s，60 20 s，40个循环；步骤3熔解曲线95 0 s，65 15 s，95 0 s。每个反应管均设置复管，重复试验2次。表1 荧光定量PCR引物 1.5 PCR产物电泳分析 配制1.5%琼脂糖凝胶，40 V电泳120 min，观察结果，凝胶成像系统成像。 1.6 数据分析 对于每一个样品，其浓度和荧光信号增长高于背景或达到阈值时对应的循环数（Ct值）一一对应。通过标准曲线，Lightcycler配套软件可计算出待测样品的初始模板量。通过这些数值，我们可以计算出每个样品femA基因相对拷贝数。 2 结 果 2.1 实时荧光定量PCR检测方法的评估 以BB270提取的RNA逆转录成的cDNA10倍稀释分别制作目的基因和内参基因扩增标准曲线，见图1，2。同时得出目的基因扩增方程Y1=-3.167X1+14.92、内参基因扩增方程Y2=-3.286X2+14.81（Y：每个PCR反应测得的Ct值；X：原始基因拷贝数的对数值）。目的基因熔解曲线见图3。通过设计金黄色葡萄球菌femA、gyrB基因对应的特异引物，熔解曲线显示出很清晰的熔解峰，而没有其他的非特异产物，以BB270为参照，每组样本都呈现出良好的线性标准曲线。 2.2 femA基因在所检测菌株中的存在情况 在所有选取的16株菌中均检测到femA基因的表达。 2.3 femA表达水平 以BB270 femA表达水平为标准，定为100%，其他菌株femA表达水平均与之相比。金黄色葡萄球菌MIC与femA表达水平关系见表2。可以看出femA表达水平随MIC水平的变化而变化。 表2 16株金黄色葡萄球菌femA表达水平 3 讨 论 实时荧光定量PCR是近年来定量核酸较为准确的方法，可根据样品的循环阈值参照标准曲线，经计算机处理后可准确计算出标本内核酸的起始浓度。SYBR Green 是一种只与双链DNA结合的染料，当它与双链DNA结合时，发出荧光，随着PCR产物的增加，产物与SYBR Green 结合的量也增大，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，整个过程要求高质量的RNA、内参和目的基因引物特异性、PCR扩增效率一致、重复试验平衡差异等来保证结果的可靠性。本实验基于SYBR Green 的实时荧光定量PCR方法用于本实验所得结果标准曲线线性关系好，熔解峰单一，复管及重复试验结果一致，证明特异性好、可信度高。 femA是MRSA耐药表达的重要辅助基因，参与细胞壁肽聚糖五肽交联桥2，3位甘氨酸的加入，缺失时能导致金黄色葡萄球菌对苯唑西林耐药水平的下降2。本文检测到所有菌株中均有femA表达，与femA涉及到金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖合成的功能有关。本文主要为比较不同菌株之间femA表达水平有无差异，故并未构建标准RNA定量标准品，而仅以高耐菌株BB270的femA表达量为基准，用实时荧光定量PCR相对定量比较了不同菌株femA表达水平高低，结果提示高耐株femA表达水平明显高于低耐和敏感株，与预期结果一致，但检测菌株数量较少尚不能得出统计学结论，有待于进一步扩大样本量后明确。 综上，采用荧光定量PCR方法检测金黄色葡萄球菌femA并进行相对定量，是一种稳定性、精确度、特异性较好的检测方法。【参考文献】 1 Berger-Bchi B, Barberis-Maino L, Strssle A, et al. femA， a host-mediated factor essential for methicillin resistance in Staphylococcus aureus: molecular cloning and characterization J. 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