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尿素酶基因在枸橼酸杆菌中的表达【摘要】 目的:研究尿素酶基因在枸橼酸杆菌中的表达情况。方法：通过PCR检测枸橼酸杆菌中是否存在尿素酶基因，而后运用尿素酶诊断试剂对其是否表达进行分析。结果：39株实验枸橼酸杆菌的尿素酶基因均为阳性，只有5株菌株尿素酶表达为阳性。结论：尿素酶基因阳性的枸橼酸杆菌不一定都能表达尿素酶。 【关键词】 枸橼酸杆菌 聚合酶链式反应 尿素酶 Abstract Objective:To detect the expression of urease genes in Citrobacter.Methods:Using PCR to analyze urease genes,and then using urease diagnosing reagent to discover the expression of urease genes.Results:thirty-nine citrobacters have urease genes，but only five have urease expression positive result. Conclusion:positive urease genes dont totally express urease. Key words Citrobacter; PCR; Urease 尿素酶基因（ure）的编码产物为尿素酶（Ure），尿素酶是一种人和动物胃肠道及泌尿道细菌感染中常见的酶，它既是人和动物中某些致病菌的致病因子之一，又是某些氮源性腐败物转化所必须具备的酶之一，它是人类首次获得晶体并发现含有镍离子的金属酶。尿素酶在镍离子的作用下可被激活，分解尿素产生氨和二氧化碳，是小肠结肠炎耶尔森菌的重要毒力因子。 小肠结肠炎耶尔森菌( Yersinia enterocolitica，简称Y.e)是自20世纪80年代以来引起国际上广泛注意的一种人畜共染病原细菌，广泛分布于自然界，已从人、动物、土壤、水和多种食品中分离出来，是能在冷藏温度下生长的少数肠道致病菌之一，全球由该菌引起的食源性疾病爆发已有数十起。 枸橼酸杆菌，又名柠檬酸杆菌，是人和动物肠道的正常菌群,属条件致病菌，常导致院内感染，近年来逐渐引起人们的重视。该菌属与肠杆菌科其它菌属之间的抗原关系密切，其抗原性与沙门菌属和埃希菌属的部分菌种之间有交叉反应，。 1 材料与方法 1.1 材料 Taq酶、dNTP均购自华美生物工程公司；核酸分子量标准购于大连宝生物公司；切胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；尿素酶诊断试剂购自北京陆桥生物技术公司。试验菌株为2000年河南、徐州及南昌送检的从24例腹泻病人、13例自家畜家禽的粪便标本中分离到的枸橼酸杆菌37株，购于生物制品检定所的捷克分离菌株2株；大肠杆菌K12 MG1655作为阴性对照；小肠结肠炎耶尔森菌标准菌株52211作为阳性对照。菌株培养用脑心培养基。 1.2 方法 1.2.1 PCR：DNA 提取按照天为时代试剂盒的细菌基因组DNA提取方法获得，引物由上海生物工程公司合成。扩增结束后，利用1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后在凝胶成像仪上观测结果。 1.2.2 尿素酶实验:细菌在固体脑心培养基上培养过夜，次日挑取单菌落入2 mL无菌水溶液中, 使其形成0.5麦氏单位的菌悬液，从上述菌悬液中取3滴入需实验的尿素酶安瓿瓶中，然后将上述安瓿瓶置于37 孵箱中培养24 h后观察结果。 1.2.3 序列测定：将尿素酶表型阳性菌株枸8和枸69的ureD切胶回收，送六合通公司进行序列测定。 2 结果 2.1 ure的检测结果 在所检测的枸橼酸杆菌中都存在ure。 2.2 尿素酶表型实验结果 尿素酶实验中，其培养液的原色为橙红色，阳性反应的颜色变为玫瑰红色或红色；阴性反应的颜色仍为橙红或变为黄色。本实验阳性对照为小肠结肠炎耶尔森菌标准菌株52211，其尿素酶反应后的颜色为玫瑰红；编号分别为枸8、枸69、枸80、枸81、枸93的5株实验菌株尿素酶表型实验为阳性，其中枸69的反应液由橙红变为玫瑰红，其余阳性菌株的反应液变为红色。 2.3 测序菌株结果分析 测序的菌株序列首先使用Chromas软件观察测序质量，而后应用软件blast在NCBI和本室建立的核糖体共有序列数据库进行比对，比对的结果根据序列的相似性程度百分比进行分类，统计信息，进行分析。 3 讨论 尿素酶是人和动物胃肠道及泌尿道细菌感染常见的酶，它既是人和动物致病菌的致病因子之一，又是某些氮源性腐败物转化所必需具备的酶之一。它是人类首次获得晶体并发现含有Ni2+的金属酶，活性调节由活性部位的镍含量决定，该酶的活性需在全酶的六个活性位点上插入Ni2+，这个插入过程由尿素酶基因簇中辅助基因编码的蛋白来完成。奇异变形杆菌、产气克雷伯菌、小肠结肠炎耶尔森菌、幽门螺杆菌等细菌中都存在ure基因，尽管基因存在差异，但尿素酶的氨基酸序列相当保守，这与尿素酶在生物体中的功能一致。尿素酶基因的表达可能与基因的调节、启动子的确定、转录的调节、mRNA的长度等密切相关。 在所检测的枸橼酸杆菌中，其ure基本上都为阳性，ureD是决定尿素酶表达的关键性因素。在进行枸8和枸69尿素酶阳性实验菌株的ureD序列分析后发现：尿素酶表型阳性与阴性的菌株，UreD的氨基酸方面存在差异，枸8：84位氨基酸由天冬酰胺->赖氨酸；枸69：64位氨基酸由丙氨酸->苏氨酸，71位氨基酸由亮氨酸->精氨酸，90位氨基酸由亮氨酸->缬氨酸，130位缺失谷氨酰胺。这些变异的氨基酸可能在尿素酶表达方面有重要作用。此外发现ureG对尿素酶的表达影响不大。如果将尿素酶阴性菌株的特定氨基酸进行突变，是否可促进其表达，还有待进一步的研究。 这些尿素酶阳性的菌株对机体有何危害，还有待进一步的动物实验来验证；铁摄取性调节因子（fur）可增加ure基因的表达，如果在反应体系中加入fur是否会增加枸橼酸杆菌中ure基因的表达，研究还需继续；ure基因簇与EHEC的O26、O111、O157血清型具有相关性，推测枸橼酸杆菌中的ure基因簇的表达与血清型也有一定关系。【参考文献】 Mobley HL,Island MD,Hausinger RP.Molecular biology of microbial ureases.Microbiol Rev,1995,59(3):451480. Koper TE, El-Sheikh AF, Norton JM,et al.Urease-Encoding Genes in Ammonia-Oxidizing Bacteria.Appl Environ Microbiol,2004,70(4):23422348. Heimer SR, Welch RA.,Perna NT,et al.Urease of Enterohemorrhagic Escherichia coli:Evidence for Regul