异位子宫内膜孕激素受体亚型表达与局部孕激素抵抗.doc

异位子宫内膜孕激素受体亚型表达与局部孕激素抵抗 作者：曲军英, 欧湘红, 杨代兴, 张声, 林经安, 马炎辉【关键词】 子宫内膜异位症;,孕激素；,孕激素酮摘要: 目的 探讨卵巢子宫内膜异位症(EMS)病灶对生理状态的孕激素水平反应不良是否由局部孕激素受体亚型分布及数量改变或功能缺陷所致。方法 采用RTPCR技术和免疫组织化学方法,检测45例EMS患者的卵巢异位子宫内膜(卵巢EMS组)和在位内膜(在位内膜组)及35例其他患者的正常子宫内膜(对照组)的孕激素受体PR(A+B)、孕激素受体亚型A、B(PRA、PRB)mRNA及其蛋白的表达。 结果(1)对照组和在位内膜组的PR表达在增生期增强，并随分泌期逐渐减弱；PRA占优势，PRB/PRA比值在整个月经周期保持相对恒定。(2)卵巢EMS组PRA、PRB、PR(A+B)表达绝对低于对照组(P<0.01),无周期性变化。异位内膜腺上皮PRA表达呈绝对降低，而间质中PRB表达相对增高，PRA不占优势,PRB/PR(A+B)显著增高(P<0.01)。结论异位子宫内膜存在局部孕激素受体亚型数量和比值改变,可能是子宫内膜异位症孕激素抵抗现象的主要分子机制。关键词: 子宫内膜异位症; 孕激素； 孕激素酮ABSTRACT: Objective To study the expression and distribution of progesterone subtype receptors(PR) in ovarian endometriosis.Methods The levels of PR(A+B) were assessed by RTPCR and PR(A+B) protein were detected by immunohistochemical assay in 45 ovarian endometriosis and their eutopic endometrium and 35 normal endometrium during the same menstrual cycle. Results PR expression was gradually increased during proliferative phase in the normal endometrium and eutopic endometrium, but gradually decreased along with the secretary phase.PRA was dominant during the menstualmenstrual cycle.However, the ratio PRB/PRA was maintained relatively constant. Compared with the normal endometrium, the expression of PRB and PR(AB) mRNA were lower(P<0.01) in ovarian endometriosis and showed no periodic variation during the menstrual cycle. In endometriotic gland epithelial cells, PRA protein was decreased absolutely, whereas in the stroma cell PRB expression was relatively increased and the ratio PRB/PR(A+B) was very significantly higher than that in normal endometrium(P<0.01). Conclusion A wide variety of concentrations of the PRB/PRA ratios in the endometriotic tissue might be considered as one of the molecular mechanisms of the progesterone resistance in endometriosis.KEY WORDS: endometriosis; progestin; progesterone 子宫内膜异位症(EMS)是一种雌激素依赖性疾病,已有研究发现,尽管EMS患者的血清孕激素浓度与正常妇女相同,但腹腔液中孕激素(P)的水平却是后者的34倍1。临床病理发现,异位腺上皮多数保持增生状态,黄体期分泌反应差甚至无反应2。Metzger报告用大剂量的孕激素治疗1例EMS患者无效,术后病理报告异位内膜增生活跃,免疫组织化学提示雌激素受体(ER)阴性,而孕激素受体(PR)阳性3。Zong认为这种孕激素抵抗现象可能是由于缺乏足够有功能的PR基因4。笔者设想,可能由于孕激素受体亚型改变,导致孕激素作用缺陷和局部雌激素代谢异常,特研究异位子宫内膜孕激素受体亚型的表达及与该现象有关的分子机制，报告如下。1 对象与方法1.1 对象 卵巢EMS患者为2003年11月2004年12月在福建医科大学附属第一医院及福建省妇幼保健院行腹腔镜或开腹手术获取的卵巢异位子宫内膜,共45例(卵巢EMS组),其中35例同时刮取子宫前、后壁内膜组织各1条(在位内膜组)。同法另取35例未经放、化疗治疗的宫颈癌aa患者的子宫标本内膜，以其代表正常子宫内膜(对照组)。所有入选病例均为已婚,术前未用任何激素类药物治疗,无内科合并症,有正常月经周期(2631 d),年龄(295)岁(2340岁)。 实验前将卵巢异位子宫内膜标本行HE染色,光镜下可见子宫内膜腺上皮和间质细胞者入选卵巢EMS组。在位内膜组和对照组子宫内膜月经期根据其月经周期推算,并符合Noyes分期病理学图像5。1.2 材料1.2.1 引物 由上海生工生物技术服务有限公司合成,序列为:PR(AB)上游(19501967 bp):5AGC CGG TCC GCG TCC AAG3下游(21742191 bp):5CCA CCC AGA GCC CGA GGG3PRB上游(424 bp):5ACT GAG CTG AAG GCA AAG GGT3下游(186204 bp):5GTC CTG TCC CTG GCA GGG C3PR(AB)和PRB目的基因片断分别为242和201 bp。actin(内参基因)引物序列: 上游:5GGC ATG GGT CAG AAG GAT TCC3 下游:5ATG TCA CGC CAC GAT TTC CCG C3管家基因片断500 bp。以上引物均参照说明书用焦碳酸二乙醇(DEPC)水溶解,终浓度为1 pmol/L。1.2.2 RTPCR试剂 Trizol(RNA提取试剂,美国Promega公司),MMuLV反转录酶系统(美国MBI公司);5 U/L Taq DNA聚合酶(上海博亚生物技术有限公司)。1.2.3 免疫组织化学试剂 鼠抗人PR(A+B)是总的孕激素受体（包含PRA和PRB）结合的单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。鼠抗人PRA、PRB的单克隆抗体,选择克隆型号hPRa7的一抗,只能识别PRA,不能识别PRB;hPRa2型单克隆抗体特异性识别PRB(美国NeoMarkers公司)。二抗为羊抗鼠免疫球蛋白(美国Dako公司)。1.3 方法1.3.1 取材 所有标本取材后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗标本3次,在离体后20 min内取新鲜组织50 mg立即冻存于-72 冰箱。卵巢异位子宫内膜组织经HE染色,镜下确定异位腺上皮和间质细胞。所有待检标本于2 h内提取总RNA,并立即逆转录成cDNA,置于-20 冰箱中备用。一部分标本立即固定于4多聚甲醛,乙醇脱水,石蜡包埋,切片机连续切片。1.3.2 RTPCR扩增PR(AB)、PRB 按照PCR试剂盒说明书进行,应用反应体系50 L,94 预变性4 min后,按照94 30 s60 60 s72 120 s，进行35个循环,最后72 延伸10 min。1.3.3 免疫组织化学检测PR(AB),PRB,PRA 采用免疫组织化学两步法(labbled dextran polymer method,LDP)进行。1.4 结果判断1.4.1 扩增产物鉴定 取PCR产物8 L,置1.5琼脂糖凝胶中电泳,以puc Mix Marker作为相对分子质量标准,电泳结果用凝胶扫描分析系统(GD2000)对目的基因及actin进行光密度扫描,以目的基因与actin基因光密度比值反映该基因mRNA的相对表达水平。1.4.2 免疫组织化学检测结果判断 由两位病理科医生采用双盲法判断实验结果。3种抗体都表达在腺上皮和间质细胞核内,阳性染色者细胞核内有棕黄色颗粒沉着。判断标准如下:选择具有代表性的有异位腺上皮和间质细胞的10个高倍镜视野(400)观察,并随机计数50个腺上皮及间质细胞,结果依染色强弱和染色百分比两项来评分。得分标准:弱表达为1分,中度表达为2分,强表达为3分,无表达为0分;半定量得分阳性细胞染色强度阳性细胞百分数3。1.5 统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件进行统计分析。计量资料以xs表示,等级资料采用频数计数,非参数检验(MannWhitney test)。P<0.05为差别有统计学意义。2 结果2.1 PR(A+B)、PRB mRNA在3组子宫内膜的表达 2琼脂糖电泳,发现在同一泳道201,242,500 bp处分别可见PRB、PR(A+B)和actin产物的清晰条带,周围无杂带(图1,2)。115例均见内参照actin mRNA的表达。 M:DNA marker; 1:同增生期卵巢异位内膜PR(A+B); 2:同增生期卵巢异位内膜PRB; 3: 同分泌期卵巢异位内膜PR(AB); 4: 同分泌期卵巢异位内膜PRB. PR:孕激素受体.2.1.1 对照组 子宫内膜PR(A+B)和PRB mRNA增生期较分泌期表达高(P<0.01),至增生晚期达高峰,分泌期逐渐减少,分泌晚期几乎无表达,呈周期性改变。但各月经期别间PRB/PR(A+B)mRNA比率差别无统计学意义(P0.05),基本保持一恒定水平(表1)。2.1.2 在位内膜组 与月经周期中EMS组与对照组内膜PR(A+B)、PRB mRNA及PRB/PR(A+B)表达的规律性和量比较,差别无统计学意义(P>0.05,表1）。2.1.3 卵巢EMS组 与对照组比较,卵巢EMS异位内膜的PR(A+B)和PRB mRNA总的表达量显著减少(P<0.01),并且无明显周期性变化,使分泌晚期的PRB mRNA表达相对高于同期的对照组;PRB/PR(A+B)mRNA的比值显著高于对照组和在位内膜组(P<0.01),说明卵巢EMS组主要以PRB表达为主,PRA表达显著减少(图2,表1)。表1 3组子宫内膜PR(A+B)、PRB mRNA在EMS、在位内膜、对照组子宫内膜的表达（略）2.2 PR(A+B)、PRA和PRB蛋白在3组、内膜腺上皮和间质细胞的表达2.2.1 对照组 腺上皮细胞同一细胞核内既表达PRA又表达PRB,增生期PRA和PRB表达相近;增生中晚期达高峰;自分泌早期始,PRA和PRB减少,分泌晚期几乎无表达。整个月经周期间质主要以PRA表达为主,PRB表达少,增生中晚期达高峰,至分泌晚期仍有散在的细胞表达PRA(图3)。2.2.2 在位内膜组 腺上皮和间质中PRA、PRB的表达量和表达特征与对照组差别无统计学意义(P>0.05)。2.2.3 卵巢EMS组 腺上皮细胞PR(AB)表达少于对照组(P<0.01),以卵巢EMS单层的腺上皮减少为著,但有完整腺体的腺上皮细胞PR表达高于前者;异位腺上皮中PRB和PRA蛋白表达水平均明显低于对照组(P<0.01);异位间质细胞PR(AB)水平与对照组差别无统计学意义(P0.05),但PRB的表达显著高于对照组(P<0.01);异位腺上皮和间质细胞PRB/PRA和PRB/PR(A+B)均显著高于对照组;异位内膜PR(AB)、PRA和PRB的表达无周期性改变,分泌期间质中PRB、PRA表达相对高于同期对照组(表2)。表2 对照组与卵巢EMS组PR(A+B)、PRA和PRB蛋白在内膜腺上皮和间质细胞的表达（略）3 讨论3.1子宫内膜PR亚型及其功能 人PR有多种亚型如PRA、PRB、PRC、PRM等,目前研究较多的是含933个氨基酸的PRB和在氨基末端被截短164个氨基酸的PRA,二者为同一基因编码,其mRNA N末端含有2个AUG (其1位于744 bp，其2位于1 236 bp) 分别是PRB和PRA的转录起始位点，由两个不同的启动子A，B转录成不同的PRA和PRB mRNA。PRB和PRA mRNA都有4个外显子,两个mRNA除了PRB的第一个外显子比PRA长492 bp外,其他序列一致。故反转录成cDNA后,只能针对PRB第一个外显子特异的492 bp区设计特异性PRB的引物,不能设计PRA的特异引物,但能在PRA、PRB的共同区设计既能针对PRA,又能针对PRB扩增的引物6。本实验用RTPCR的实验方法只能扩增出PRB和PR(AB)基因,不能扩增出PRA基因。已有研究发现,PRB活化转录作用强于PRA,能调节内膜腺上皮的有丝分裂和分泌,在没有PRA拮抗时,PRB表现为促进子宫内膜上皮增生。PRA调节间质细胞有丝分裂和分化，同时PRA不仅拮抗雌激素介导的上皮增生,还可拮抗PRB诱导的上皮增生。通常PR以二聚体形式存在,靶细胞中PRA、PRB蛋白比率不同可能会改变各种二聚化的相对成分,从而影响整个细胞对孕激素的反应7。3.2 异位内膜PRA、PRB表达改变与孕激素抵抗的关系 Misao等用RTPCR检测卵巢EMS组织,发现PRB/PRA明显高于在位内膜,提示卵巢异位子宫内膜组织PRB优势表达可能是导致异位灶异常增生的原因8,而Attia等未能在腹膜的异位内膜组织检测出PRB蛋白,推论仅有PRA的存在抑制了孕激素的作用9。本组资料表明：(1)正常子宫内膜的PR表达在增生期增强，并随分泌期逐渐减弱；PRA占优势，但PRB/PRA比值在整个月经周期中保持相对恒定。(2)卵巢异位子宫内膜中PRA，PRB，PR(AB)表达绝对低于正常(P<0.01),并且无周期性变化；(3)异位内膜腺上皮PRA表达呈绝对降低，而间质中PRB表达却相对增高，PRA不占优势，PRB/PR(AB)显著增高(P<0.01)。这一变化使腺上皮由于PR的减少而对孕激素反应差,孕激素无法发挥其拮抗雌激素的促增生分裂作用;而局部PRB/PRA比值增高,增强了PRB促上皮增生作用,可能与卵巢异位内膜在整个月经周期都保持增生期状态有关。Kurita等认为,雌二醇(E2)诱导的上皮DNA合成是由间质中的PR调节,其中的PRA、PRB和ER可能是间质因子之一10。本研究所见异位内膜间质PRB表达相对增高和PRB/PR(AB)比值变化正是一种间质依赖的上皮生长信号的重要环节,它促进了雌激素依赖的内膜增生作用，从而表现EMS患者对生理浓度甚至大剂量孕酮反应差，即所谓“孕激素抵抗现象”。 本研究结果提示,异位子宫内膜存在局部PR亚型数量和比值改变,可能是导致异位子宫内膜病灶对体内生理浓度孕激素缺乏反应,对治疗量孕激素反应不良甚至促进生长的主要原因,是子宫内膜异位症孕激素抵抗现象的主要分子机制之一。其中异位病灶间质的孕激素亚型受体改变,可能与局部雌激素代谢和信号传导有关,与EMS的关系有待进一步探讨。 (致谢：本研究中有关分子生物学实验部分得到福建医科大学基础医学院林旭教授的悉心指导,特此致谢。)参考文献：1Tsai S J,Wu M H,Lin C C,et al. 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