抗HBsAg人源抗体Fab片段原核表达的优化.doc

抗HBsAg人源抗体Fab片段原核表达的优化作者：焦永军, 曾晓燕, 史智扬, 汪华, 崔仑标, 龚希萍, 薛蓉, 周镇先【摘要】 目的: 优化抗HBsAg人源抗体片段hFabHB1在大肠杆菌中功能性表达的条件。方法: 通过测定宿主菌培养物A600值观察10 g/L的葡萄糖对宿主菌生长的影响; 比较诱导前是否更换培养液的2种不同条件hFabHB1的表达产量; 比较在37和25 2种诱导温度下功能性hFabHB1分子的表达量以及Fd和轻链表达的平衡性。大量表达的功能性hFabHB1分子经亲和层析纯化后, 用ELISA鉴定其生物活性。结果: 在培养液中加入10 g/L的葡萄糖可有效抑制重组蛋白的本底表达, 增加宿主菌的生长速度; 在加入IPTG诱导前更换培养液可明显提高hFabHB1的表达产量; 25的诱导温度比37能表达更多的功能性Fab分子, 并且Fd和轻链表达量也更趋于平衡。经亲和层析纯化的hFabHB1分子可与HBsAg特异性结合。结论: 实验结果为在原核系统中大量表达该抗体片段提供了技术储备。 【关键词】 抗HBsAg人源抗体 hFabHB1 原核表达 优化乙型病毒性肝炎（简称乙肝）是一类严重危害人体健康的感染性疾病, 全球约有3.5亿人感染乙肝病毒（HBV）, 其中近10%的患者可因持续感染导致肝硬化或肝细胞癌1。针对HBsAg的中和抗体可阻断乙肝病毒对肝细胞的吸附, 从而避免了病毒攻击。目前HBsAg 的中和抗体作为免疫治疗剂已在临床上广泛使用, 如对HBsAg阳性产妇生产的新生儿进行抗体的被动免疫, 以阻断母婴垂直传播2; 对肝移植的乙肝患者进行抗体的紧急接种来保护移植肝组织免受病毒感染等3。但目前使用的抗体均来自人血清, 价格贵, 来源有限, 且存在其他病原体感染的潜在威胁2。hFabHB1是通过基因工程技术, 从HBV免疫型噬菌体抗体文库中筛选的全人源Fab型抗体片段分子, 其靶分子是HBV HBsAg, 实验证实hFabHB1可有效阻止HBV与人原代肝细胞的结合, 是一个具有潜在临床应用价值的候选分子。但hFabHB1在原核表达系统中存在问题, 主要表现在, 组成Fab分子的重链Fd段和轻链大多只能以包涵体形式表达, 形成有功能的Fab异二聚体分子较少, 并且Fd和轻链表达量失衡, 轻链大于Fd。本研究对影响hFabHB1功能性表达的各类因素进行优化, 如抑制宿主细菌的本底表达、 在诱导前更换培养液、 降低诱导温度等, 使其最终表达产量达到20 mg/L。1 材料和方法1.1 材料 重组质粒pComb3xhFabHB1为从噬菌体抗体库中筛出的、 能特异性与HBsAg结合的抗体克隆; 大肠杆菌表达菌株Top10F购自Invitrogen公司; Protein L柱填料购自Pierce公司, HRP标记的山羊抗人IgG（Fab 特异性）抗体购自Sigma公司; HBsAg由深圳康泰股份有限公司赠送。1.2 方法1.2.1 葡萄糖对宿主细菌生长的影响 重组质粒pComb3xhFabHB1转化Top10F化学感受态细胞, 挑单菌落置10 mL LB培养液（含100 mg/L氨苄青霉素, AmpR） 37 250 r/min培养过夜。次日用50 mL LB培养液（100 mg/L AmpR） 1100稀释过夜培养物, 平均分成A、 B2份, 在A中加入终浓度为10 g/L的葡萄糖, B中不加。A、 B2份同时在37、 250 r/min培养, 每2 h测A600值, 共培养8 h。1.2.2 诱导前更换培养液对表达产量的影响 用50 mL LB培养液（含有100 mg/L AmpR和10 g/L的葡萄糖） 1100稀释过夜培养物, 平均分成A、 B 2份, 37培养约6 h至A600值=1.0, 对A, 1500 g离心10 min, 然后用同等体积的新鲜LB培养液（含有100 mg/L AmpR）重悬, 对B不做处理。在A、 B中同时分别加入终浓度为1 mmol/L的IPTG, 37诱导3 h。取80 L培养物, 加入20 L5还原型loading buffer, 100煮沸10 min。样品经瞬时离心后, 每个样品上样5 L行Western blot, 抗体用HRP标记的山羊抗人IgG（Fab 特异性）, 比较表达量。1.2.3 温度对hFabHB1分子功能性表达的影响 用50 mL LB培养液（含有100 mg/L AmpR和10 g/L的葡萄糖） 1100稀释过夜培养物, 37培养约6 h至A600值=1.0, 更换培养液, 加入终浓度为1 mmol/L的IPTG, 平均分成A、 B2份, 它们分别在37和25诱导12 h。取1 mL培养物, 10000 g离心2 min, 取80 L表达上清, 加入20 L5非还原型loading buffer, 混匀, 不煮沸。另取80 L表达上清, 加入20 L 5还原型loading buffer, 混匀, 100煮沸10 min。每个样品上样5 L行Western blot, 抗体用HRP标记的山羊抗人IgG（Fab 特异性）, 比较重、 轻链表达均衡性和功能性hFabHB1表达量。1.2.4 亲和层析大量纯化功能性hFabHB1蛋白 用1000mL LB培养液（含有100 mg/L AmpR和10 g/L的葡萄糖） 1100稀释过夜培养物, 37培养约6 h至A600值=1.0, 更换培养液, 加入终浓度为1 mmol/L的IPTG, 25诱导过夜。5000 g离心20 min, 分别收集上清和沉淀。调节上清液pH至7.0, 过0.45 mol/L的微孔滤膜; 对于存在于细菌质周腔（periplasmic space）中功能性蛋白, 则在表达沉淀中加入原培养体积50 g/L的蔗糖高渗缓冲液（50 mmol/L TrisHCl, 200 g/L蔗糖, 1 mmol/L EDTA, pH8.0）4, 置冰上1 h, 轻微震荡, 30000 g离心30 min, 收集上清液, 与表达上清混合。用Protein L亲和层析柱进行纯化, 计算表达产量。纯化的hFabHB1分子分别在还原和非还原条件下电泳。1.2.5 hFabHB1蛋白的活性测定 采用ELISA方法。将HBsAg稀释至10 mg/L 4包被过夜（100 L/孔）, 50 g/L脱脂奶粉封闭液4封闭过夜, 加入hFabHB1抗体分子（纯化的hFabHB1分子1500稀释, 浓度为1 mg/L, 100 L/孔）, 同时用乙肝阳性血清和正常人血清（11000稀释）分别作阳性、阴性参考, 于37孵育2 h, 充分洗涤后, 加入HRP标记的山羊抗人IgG（Fab特异性）, 37孵育1 h, 充分洗涤后, 加底物室温显色30 min, 加入2 mol/L H2SO450 L/孔终止反应。在酶标仪上以空白孔调零, 读A450值。2 结果2.1 宿主细菌生长条件的优化 在宿主菌的培养物中加入终浓度为10 g/L的葡萄糖可明显促进细菌的生长速度, 其A600值可在6.5 h内升至1.0, 而未加葡萄糖的对照组在8 h的培养时间内其A600值只有0.25（图1）。重组蛋白的表达是建立在一定数量细菌的基础之上的, 在诱导前, 必须尽可能抑制宿主菌的本底表达, 加快其分裂速度。图1 葡萄糖对宿主细菌生长的影响（略）2.2 更换培养基对hFabHB1表达产量的影响 在加入IPTG诱导之前, 更换表达培养液可明显提高重组抗体hFabHB1的产量（图2）, 但此处通过Western blot检测的hFabHB1包括可溶性表达和包涵体表达两部分, 包涵体的功能复性存在困难, 并且组成Fab分子的Fd和轻链的表达失衡问题依然存在。图2 Wester blot分析在诱导前更换培养液对表达产量的影响（略）1: IPTG诱导前更换培养液hFabHB1的表达; 2: IPTG诱导前不更换培养液hFabHB1的表达.2.3 温度对hFabHB1分子功能性表达的影响 随着表达时间的延长, Fab分子可分泌至培养上清液中, 但在不同的诱导温度下, 功能性Fab分子的含量存在着具大的差别, 25诱导条件下的分泌量明显大于37的量, 并且在25条件下, Fd和轻链的表达量更趋于平衡（图3）。虽然在37比25的诱导下菌体能表达更多的蛋白, 但可能都以不溶的包涵体形式存在, 分泌到外面上清中的蛋白极少。图3 不同温度下功能性hFabHB1表达产量的比较（略）1, 3: 25诱导条件下hFabHB1的表达（分别在非还原和还原条件下）; 2, 4: 37诱导条件下hFabHB1的表达（分别在非还原和还原条件下）.2.4 亲和层析大量纯化功能性hFabHB1蛋白 表达上清中的重组蛋白经调节pH和离心处理后可直接进行亲和层析纯化, 对于存在于细胞质周腔的Fab, 通过在表达菌体沉淀中加入蔗糖渗出缓冲液促使蛋白溢出, 从而减少了超声波碎菌带来的杂蛋白污染。重组蛋白经Protein L亲和层析柱纯化后, 其最终产量为20 mg/L。在还原型SDSPAGE上hFabHB1分子的二硫键断裂后可分为Fd和轻链两条带; 而在非还原型SDSPAGE上hFabHB1分子则表现为一条带, Mr约为50000 (图4)。图4 SDSPAGE检测纯化的hFabHB1蛋白（略）1: 蛋白marker; 2: 还原条件下纯化的hFabHB1; 3: 非还原条件下纯化的hFabHB1.2.5 ELISA测定hFabHB1蛋白活性 与乙肝阳性血清及正常人血清（A450值分别为1.30和0.14）相比, hFabHB1的A450值为0.90, 说明其能与HBsAg有很好的结合。3 讨论 乙肝治疗性抗体在临床上的用量很大, 与其他治疗用重组蛋白类似, 表达产量往往成为瓶颈问题5。影响hFabHB1分子在大肠杆菌中的成功表达主要取决于转录和翻译2个方面的因素。本研究中, 使用的表达载体pComb3xss6为氨苄抗性（含bla基因）, 负责外源基因转录的为乳糖启动子（lacUV5）, 在设计上为双顺反子结构（dicistronic expression cassette）, 编码轻链的基因在前, Fd基因在后, 拥有2个翻译起始位点。在IPTG的诱导下外源基因开始转录、 表达。但lac操纵子存在明显的“渗漏”现象, 在无IPTG情况下亦有外原基因本底表达, 这不利于细菌的生长。而葡萄糖通过对lac操纵子的阻遏作用能抑制目的蛋白的表达7。同时, 人源Fab分子对于宿主细菌来说为异源蛋白, 可能存在一定的毒性, Fab的本底表达降低了其分裂的速度, 加入葡萄糖可明显提高其生长状况。重组细菌在培养过程分泌大量的内酰胺酶, 可降解培养液中氨苄青霉素; 同时, 细菌在培养过程中能产生酸性物质, 降低培养基的pH值, 而氨苄青霉素在低pH值条件下极易水解8。这就意味着随着培养时间的延长, 失去重组质粒的细菌由于没有氨苄青霉素的监控而快速分裂, 其密度逐渐超过重组菌体而使得最终重组蛋白的表达产量下降。而在加入IPTG进行诱导之前更换培养液, 一方面可去除培养液中内酰胺酶和调节pH值, 另外可把氨苄青霉素的浓度恢复到可监控的水平, 及时杀死突变的菌株, 从而提高重组蛋白的表达产量。组成Fab的Fd和轻链分子分别在胞质表达, 通过各自的信号肽引导运输到质周腔中, 该腔为氧化的环境, 并可提供蛋白二硫键异构酶等多种伴侣分子, 利于Fd和轻链分子链内、 链间二硫键的形成9。随着培养时间的延长, Fab可透过质周腔外壁多孔的膜结构溢到外界环境中10。因此, 可以通过检测表达上清中功能性Fab分子的含量, 即可推断其在质周腔中的表达水平。在高温条件下（如37）抗体重、 轻链表达的产量增加, 但多易在胞质内形成不溶、 无活性的包涵体, 给下游的蛋白复性工作带来困难。低温虽然导致表达强度下降, 但新生的多肽分子可充分应用宿主菌提供的转运、 组装等系统资源进行功能性Fab分子的装配和分泌。对于双顺反子设计结构的载体, 位于前面的基因的表达产量往往比后面的高11, 对本系统而言, 轻链的表达量超出Fd的量。其原因是多方面的, 第一, 这可能因为宿主对下游的mRNA的翻译失去控制所致, 如能把2个读码框分别置于单独的启动子之下, 则二者表达的平衡性将会得到改善11。第二, 抗体轻链容易在质周腔中形成LL二聚体并在其中积聚, 过高温度能加剧此进程, 并且轻链能抵抗宿主酶系统的降解; 因此从宿主的蛋白分泌、 折叠等相关资源利用的角度来说, 过量的轻链不利于Fd的生成12。第三, Fd在质周腔中比轻链更容易降解, 这是因为Fd分子由抗体重链的VH和CH1组成, 缺少Fc段, 失去了其结构的完整性, 在质周腔这个酶系统较为丰富的环境中, 可能暴露了许多位点, 易受到水解酶的攻击。特别在较高温度下, 轻链的过表达和Fd的高降解更加剧了二者在组成上的不平衡性。所以本研究采用在较低的温度下诱导, 虽总体的表达水平降低, 却可以使上述趋势得到缓解, 促进Fd和轻链产量趋于平衡, 利于Fab的组装和分泌。【参考文献】 1 Seeger C, Mason WS. Hepatitis B virus biologyJ. Mol Biol Rev, 2000, 64(1): 51-68.2 Maeda F, Takekoshi M, Nagatsuka Y, et al. Production and characterization of recombinant human antiHBs Fab antibodiesJ. J Virol Methods, 2005, 127(2): 141-147.3 Muller R, Gubernatic G, Farle M, et al. Liver transplantation in HBs antigen carriers prevention of hepatitis B virus (HBV) recurrence by passive immunizationJ. J Hepatol, 1991, 13(1): 90-96.4 Kipriyanov SM, Moldenhauer G, Little M. High level production of soluble single chain antibodies in smallscale Escherichia coli culturesJ. J Immunol Methods, 1997, 200(1-2): 69-77.5 Humphreys DP, Glover DJ. Therapeutic antibody production technologies: molecules, applications, expression, and purificationJ. Curr Opin Drug Disc Dev, 2001, 4(2): 172-185.6 Barbas CFIII, Burton DR, Scott JK, et al. Phage display: A laboratory manualM. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000: 212-213.7 Grossman TH, Kawsaki ES, Punreddy SR, et al. Spontaneous cAMPdependent derepression of gene expression in stationary phase plays a role in recombinant expression instabilityJ. Gene, 1998, 209(1-2): 95-103.8 Studier FW. Prot