杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达.doc

杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达 作者：李金福, 陈建平, 杨志伟, 田玉, 马莹, 胡孝素【关键词】 杜氏利什曼原虫;,无鞭毛体蛋白基因;,体外表达Construction and expression of recombinant eucaryotic expression plasmid of amastin gene of Leishmania DonovaniAbstract AIM: To construct recombinant eukaryotic expression plasmid of amastin gene of Leishmania Donovani anddetectexpressionofthegeneinNIH3T3cells.METHODS: Amastin gene was amplified from nuclear DNA of Leishmania Donovani isolates and cloned into an eukaryotic expression vector pcDNA31(+). The recombinant plasmid was named pcDNA31amastin. NIH3T3 cell was transfected by pcDNA31amastin. Transient and stable expression of amastin gene were detected by immunofluoresence and RTPCR. RESULTS: It was found that there was high green fluorescence on the cell membrane and inside the cell. It showed that NIH3T3 cell was transfected by pcDNA31amastin successfully. CONCLUSION: A recombinant eukaryotic expression plasmid of amastin gene of Leishmania Donovani was successfully constructed, and can be expressed stably in the NIH3T3 cells.KeywordsLeishmania Donovani; amastin gene; express in vitro摘 要 目的: 构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)编码基因的真核表达重组质粒pcDNA31amastin, 并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法: 提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA31(+)中, 构建真核表达重组质粒pcDNA31amastin。以pcDNA31amastin转染NIH3T3细胞, 采用免疫荧光染色法和RTPCR分别鉴定pcDNA31amastin的瞬时表达和稳定表达。结果: 在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光, 表明pcDNA31amastin成功地转入NIH3T3细胞, 并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后, 用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因, 表明获得了稳定表达。结论: 成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒, 并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。关键词杜氏利什曼原虫; 无鞭毛体蛋白基因; 体外表达杜氏利什曼原虫是一种胞内寄生原虫, 由媒介昆虫白蛉传播, 其引起的黑热病致死率极高, WHO/TDR已将其列为6种重点防治的热带病之一。因现有疫苗效果不够理想, 目前尚无可大规模用于临床的黑热病预防接种疫苗。因而, 寻找有效的、 新的黑热病疫苗候选分子已成为当今黑热病预防研究工作的重点。近年来, 对无鞭毛体蛋白(amastin)的研究1, 2使其有望成为一种黑热病疫苗的候选分子。本研究根据GenBank中登录的4种利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因的序列, 自行设计引物, 克隆了杜氏利什曼原虫的无鞭毛体蛋白编码基因, 并将其导入质粒pcDNA31(+)中, 构建了真核表达重组质粒pcDNA31amastin, 并在NIH3T3细胞中获得稳定表达, 为进一步构建黑热病无鞭毛体蛋白基因疫苗奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料 杜氏利什曼原虫四川省汶川县人分离株(MHOM/CN/90/SC10H2)及NIH3T3细胞均由本室保存。限制性内切酶BamH I和Xho I为Fermentas公司产品。PCR扩增所用聚合酶Premix Ex Taq为宝生物工程（大连）有限公司产品。胶回收试剂盒为Bioer Technology公司产品。质粒小量提取试剂盒为Omega公司产品。T4 DNA连接酶为New England Labs公司产品。兔抗杜氏利什曼原虫血清由本室自行制备, FITC标记的羊抗兔抗体为北京成文免疫化学研究室产品。转染试剂Keygen Trans为南京凯基生物科技发展有限公司产品。总RNA提取试剂盒及cDNA第1链合成试剂盒均为上海生工生物技术有限公司产品。M199培养基、 DMEM培养基及G418均为Gibco公司产品。1.2 方法1.2.1 虫体基因组DNA的提取 将虫株从液氮中取出, 转入NNN培养基中于27培养7 d后, 转入含150 mL/L小牛血清的M199培养液中进行扩大培养。当虫体总数达510911010时收集虫体, 参照文献3的方法略加修改提取虫体基因组DNA。1.2.2 PCR引物的设计和合成 根据GenBank中登录的4种利什曼原虫无鞭毛体蛋白编码基因的序列设计一对引物, 在上游引物P1的5端添加BamH I识别序列和保护序列, 在下游引物P2的5端添加Xho I识别序列和保护序列。引物的合成由宝生物工程（大连）有限公司完成。引物的序列如下: P1: 5GGCGGATCCATGCTGTGCTCGTGCATCGTGTT3（划线处为BamH I酶切位点）; P2: 5CGCCTCGAGCTACATTATAATCAGCAGCACCAGG3（划线处为Xho I酶切位点）。1.2.3 无鞭毛体蛋白基因的扩增 PCR反应条件为94预变性3 min, 然后94变性30 s, 60退火40 s, 72延伸40 s, 共30个循环, 最后1个循环后于72再延伸10 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.4 无鞭毛体蛋白基因的克隆 将上述PCR产物、 质粒载体pcDNA31(+)分别以BamH I和Xho I双酶切, 经胶回收试剂盒纯化酶切后的产物, 并用T4 DNA连接酶将无鞭毛体蛋白基因片段与质粒pcDNA31(+)相连接。取连接产物转化预先制备的大肠杆菌DH5感受态细胞, 将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平皿上, 于37培养16 h。1.2.5 重组质粒的PCR筛选与鉴定 从上述LB平皿上, 随机挑取数个菌落分别接种入含有氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中, 于37剧烈振摇培养过夜。以P1、 P2为引物, 从各管中分别取12 L菌液直接进行PCR。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 能扩增出无鞭毛体蛋白基因片段者即为阳性的重组质粒。1.2.6 重组质粒的酶切鉴定 用质粒小量提取试剂盒从经PCR筛选、 鉴定正确的阳性重组质粒克隆中提取重组质粒DNA, 并进行BamH I和Xho I的双酶切及BamH I的单酶切, 酶切产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.7 无鞭毛体蛋白基因序列的测定 使用双脱氧链终止法全自动测序仪对PCR鉴定及酶切鉴定均正确的重组质粒进行测序。测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。1.2.8 以pcDNA31amastin转染NIH3T3细胞 转染前24 h, 将细胞培养瓶中生长状态良好的NIH3T3细胞（使用含100 mL/L小牛血清、 1105 U/L青霉素及100 mg/L链霉素的DMEM完全培养液培养）用胰蛋白酶消化, 按5105个/孔接种于6孔细胞培养板中, 当细胞生长至70%左右汇合时用于转染。实验分为pcDNA31(+)对照组和pcDNA31amastin实验组。先将5 g质粒DNA加入到100 L PBS中, 混匀后加入转染试剂10 L, 混匀, 室温放置15 min。然后, 在轻微振摇培养板的同时将混合液逐滴加入孔中, 以使混合液均匀分散。最后将培养板放置于37、 50 mL/L CO2培养箱中培养。1.2.9 目的基因瞬时表达的免疫荧光法检测 参照文献8的方法略加修改。在6孔细胞培养板中制作细胞爬片, 于转染后48 h依次经PBS清洗、 40 g/L多聚甲醛固定30 min、 PBS清洗、 20 mL/L Triton X100处理15 min、 PBS清洗及加封闭血清于37封闭15 min后, 加20 L 1200兔抗杜氏利什曼原虫血清（4过夜, PBS清洗）及1100 FITC标记的羊抗兔抗体（37孵育15 min, PBS清洗）, 加缓冲甘油封片后, 在荧光显微镜下观察结果。1.2.10 稳定表达目的基因细胞克隆的G418筛选 转染 48 h后, 换用含300 mg/L G418的培养液继续培养细胞, 每2 d更换1次培养液。当空白对照孔中的细胞完全死亡时, 换用含150 mg/L G418的培养液继续培养, 每2 d更换1次培养液, 至稳定表达目的基因的细胞克隆出现时, 接种入细胞培养瓶中扩大培养。1.2.11 目的基因稳定表达的RTPCR鉴定 经G418筛选后存活细胞生长至80%左右汇合时, 采用总RNA提取试剂盒提取其总RNA。所获总RNA经反转录后, 再用前述引物进行PCR扩增, 以鉴定其是否可稳定表达无鞭毛体蛋白基因。2 结果2.1 无鞭毛体蛋白基因的PCR扩增 用PCR方法从杜氏利什曼原虫的基因组DNA中, 扩增出同预期大小一致、 大小约550 bp的DNA片段（图1）。图1 无鞭毛体蛋白基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳（略）Fig 1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of amastin geneM:DNAmarker(DL2000);1:Amastingenefragment;2:Negativecontrol.2.2 重组质粒的PCR鉴定 对随机挑取的LB平皿上的各菌落进行PCR扩增筛选鉴定, 绝大部分扩增出大小约550 bp的DNA片段; 而空质粒对照则为阴性（图2）。图2 重组质粒PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）Fig 2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product of recombinant plasmidM: DNA marker(DL 2000); 1: PCR product of pcDNA3.1(+); 2: PCR product of pcDNA3.1amastin.2.3 重组质粒的酶切鉴定 用BamH I和Xho I对PCR鉴定正确的重组质粒进行双酶切, 可见与空质粒等大大小约5400 bp的片段和约550bp目的片段; 用BamH I对重组质粒进行单酶切, 可见大小约5900 bp的片段（图3）。图3 重组质粒的酶切鉴定（略）Fig 3 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmidM1:DNA marker(DL2000); 1:pcDNA3.1(+)/BamH I; 2: pcDNA3.1amastin/BamH I; 3: pcDNA3.1amastin/BamH I+Xho I; M2: DNA marker(marker VI).2.4 目的基因表达的免疫荧光法检测 在荧光显微镜下, pcDNA3.1amastin转染的NIH3T3细胞的细胞膜和细胞质内均有较强的绿色荧光（图4A）, 同一视野中的细胞在普通光下形态清晰（图4B）, 表明pcDNA3.1amastin已成功地转入NIH3T3细胞, 并在细胞膜和细胞质内短暂表达; 而空质粒pcDNA31(+)转染的NIH3T3细胞在荧光显微镜下未显示绿色荧光（图4C）, 同一视野中的细胞在普通光下形态也清晰（图4D）。图4 重组质粒pcDNA3.1amastin在NIH3T3细胞中表达的免疫荧光法检测（略）Fig 4 Immunofluorescence analysis of the expression of recombinant plasmid pcDNA3.1amastin in NIH3T3 cells (200)A: NIH3T3 cells transfected by pcDNA3.1amastin (under fluorescence microscope); B: NIH3T3 cells transfected by pcDNA3.1amastin (under light microscope); C: NIH3T3cellstransfectedbypcDNA3.1(+)(under fluorescence microscope); D: NIH3T3 cells transfected by pcDNA3.1(+) (under light microscope).2.5 pcDNA3.1amastin在NIH3T3细胞中稳定表达的RTPCR鉴定 经G418筛选后, 存活细胞的总RNA经RTPCR可扩增出无鞭毛体蛋白基因; 而空质粒pcDNA3.1(+)转染的NIH3T3细胞总RNA经RTPCR未扩增出任何产物（图5）, 表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得稳定表达。图5 pcDNA3.1amastin在NIH3T3细胞中表达的RTPCR检测（略）Fig 5 Detection of the expression of pcDNA3.1amastin in NIH3T3 by RTPCRM: DNA marker(DL 2000); 1: RTPCR product in NIH3T3 cells transfected by pcDNA3.1amastin; 2: RTPCR product in NIH3T3 cells transfected by pcDNA3.1(+); 3: Positive control. 3 讨论杜氏利什曼原虫隐性感染者或黑热病患者康复后, 体内可产生针对该原虫的持久保护性免疫应答, 以防止再感染, 说明利用免疫预防接种防止杜氏利什曼原虫的感染是可行的。免疫预防的免疫原可以来源于基因工程表达的蛋白或其亚单位, 也可以是编码该蛋白的基因, 但选择目的蛋白或其编码基因作为免疫原则至关重要。1994年, Teixeira等1通过对锥虫cDNA文库的差异筛选, 在国际上首次报道并成功克隆了位于锥虫虫体表面的无鞭毛体蛋白基因。2000年, 成军等4利用核苷酸数据库计算机联网检索, 发现与锥虫无鞭毛体蛋白基因同源的硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因部分片段, 之后在全球首次成功地克隆了硕大利什曼原虫的无鞭毛体蛋白基因。迄今已经发现无鞭毛体蛋白家族由45个成员所组成, 所有成员都拥有一个高度保守的由11个氨基酸组成的胞外结构域, 并且主要表达在锥虫和利什曼原虫的无鞭毛体时期, 是一种期特异性表达蛋白5。Salotra等6的研究表明, 在患黑热病后皮肤利什曼病（PKDL）时无鞭毛体蛋白的表达上调, 其在改变患者的临床表现上可能起重要作用, 以致影响黑热病的临床治疗效果。Stober等7对100种新的硕大利什曼原虫的候选疫苗进行了筛选, 发现无鞭毛体蛋白是一种最有前途的保护性抗原。加之由于无鞭毛体蛋白位于利什曼原虫虫体的表面, 在利什曼原虫感染宿主后便有更多与宿主免疫系统接触的机会, 因而有望成为抗利什曼原虫感染的候选疫苗。本研究中克隆了利什曼原虫中对人生命威胁最大的杜氏利什曼原虫的无鞭毛体蛋白基因(GenBank中的登录号为DQ864502), 成功地构建了其真核表达重组质粒pcDNA31amastin。以其转染NIH3T3细胞后, 用免疫荧光法检测显示, 在NIH3T3细胞的细胞膜和细胞质内均有绿色荧光。经G418筛选后存活细胞的总RNA经RTPCR扩增出无鞭毛体蛋白基因, 表明无鞭毛体蛋白基因可在真核细胞中稳定表达, 为黑热病无鞭毛体蛋白基因疫苗的研制提供了实验依据。参考文献:1 Teixeira SM, Russell DG, Kirchhoff CY, et al. Differentially expressed gene family encoding “amastin”, a surface protein of Trypanosoma cruzi amastigotesJ. J Biol Chem, 1994, 269(32): 20509-20516.2 成 军, 钟彦伟, 刘 妍, 等. 利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆化与序列分析J. 中华传染病杂志, 2001, 19(1): 27-31.3 Smyth AJ, Ghosh A, Hassan MQ, et al. Rapid and sensitive detection of leishmania kinetoplast DNA from spleen and blood samples of kalaazar pat