肝肾综合征大鼠肾组织葡萄糖调节蛋白与Toll样受体4的表达.doc

肝肾综合征大鼠肾组织葡萄糖调节蛋白与Toll样受体4的表达【摘要】 目的: 探讨肾组织葡萄糖调节蛋白78、 94（GRP78、 94）和Toll样受体4（TLR4）的表达及其在肝肾综合征发生中的作用。方法: 采用胆总管结扎诱导肝硬化及肝肾综合征大鼠模型（BDL组）, 术后1、 2、 4和6周各选6只大鼠取血及组织标本。从股静脉取血, 监测血浆丙氨酸转氨酶（ALT）、 总胆红素（TBil）、 尿素氮（BUN）、 肌酐（Cr）。用ELISA检测血浆肿瘤坏死因子（TNF）含量。取肝、 肾组织称其质量, 并制备标本; 用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）、 蛋白质Western blot分别检测肾组织GRP78、 94和TLR4 的mRNA 及蛋白表达。同时以假手术组设为对照（C组）。 结果: 与C组比较, BDL组各时间点大鼠肝脏、 肾脏质量及血浆ALT、 TBil和血浆TNF均明显升高（P<0.05）, 4周和6周BUN和Cr也明显升高（P<0.05）。BDL组各时间点肾组织GRP78、94 mRNA 及其蛋白表达均明显低于C组（P<0.01）, 而TLR4 mRNA 及其蛋白表达量却明显高于C组（P<0.01）。结论: 肾组织GRP78、 94表达减少可能有助于TLR4炎性信号通路激活, 并可能与肝硬化并发的肝肾综合征发生相关。 【关键词】 肝肾综合征 葡萄糖调节蛋白 Toll样受体4肝肾综合征是肝硬化失代偿期的常见并发症, 炎性损伤是其发生的主要机制之一1。近来研究认为, 内质网应激蛋白不仅是分子伴侣, 而且可作为内源性“危险分子”被Toll样受体（Tolllike receptor, TLR）识别, 而参与炎性应答2。本研究中, 我们从TLR4表达变化来探讨内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白（glucoseregulated protein, GRP）78、 94在肝肾综合征中的作用。1 材料和方法1.1 材料SD大鼠雌雄不限(体质量220250 g, 给予标准饮食、 2224、 12 h白天/黑夜循环、 湿度5560的动物房饲养), 购于浙江大学医学实验动物中心。TRIzol购于Invitrogen公司; RTPCR试剂盒购于Promega公司; TritonX100蛋白裂解液购于Sigma公司; 山羊抗大鼠GRP78/94、 TLR4、 三磷酸甘油醛脱氢酶（GADPH）单克隆抗体（mAb）及过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG 抗体购于Santa Cruz Biotechnology公司; 大鼠TNF试剂盒购于深圳晶美公司。其余试剂均购于上海生工公司。actin、 GRP78/94、 TLR4 mRNA引物由上海生工公司合成。12 方法1.2.1 引物设计TLR4引物（600 bp, NM019178）: 上游5CCA AGA ACC TAG ATC TGA GC3; 下游5GGA CAT GTA AAC CAG TCA TG3。 GRP78引物（489 bp, U16277）: 上游5GGC GGA TCG TGC CTC TCA TT3; 下游5GAC CAG TCG CTC AGC AGT CA3。GRP94引物（460 bp, BC011439）: 上游5CCA TGG CTT ATA TCC ACT TC3; 下游5GTA ATG TCA GTT GAA TGG TG3。actin引物（270 bp, NM031144）: 上游5GTA GCC ATC CAG GCT GTG TT3; 下游5GAA GTC TAG GGC AAC ATA GC3。1.2.2 大鼠肝肾综合征模型构建SD大鼠饲养1周后, 随机分为2组。实验组（BDL组）用胆总管结扎法诱导肝硬化1: 戊巴比妥腹腔麻醉SD大鼠, 开腹暴露胆总管, 用丝线在胆总管远、 近端结扎, 于两结扎中间剪断胆总管, 关腹。假手术组（Sham组）仅开腹, 暴露胆总管但不剪断, 再关腹。两组分别在术后1、 2、 4、 6周各取6只大鼠称体质量, 股静脉采血测血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）、 总胆红素（TBI）、 尿素氮（BUN）、 肌酐（CRE）及TNF含量; 然后用戊巴比妥腹腔麻醉后处死取肝、 肾并称体质量。200 mg肾组织置于-70液氮保存备用; 肝、 肾组织各500 mg以100 g/L甲醛固定, 石蜡包埋、 切片, 苏木素伊红（HE）染色。由两位病理医师双盲评价肝、 肾组织病理。1.2.3 检测方法ALT、 TBI、 BUN、 CRE于TMS1024全自动生化仪检测。1.2.4 ELISA检测血浆TNF的含量按说明书进行操作, 检测样本A450值, 用TNF标准液绘制曲线, 从曲线中得出各样本TNF含量。1.2.5 总RNA抽提和RTPCR肝组织匀浆、 TRIzol抽提RNA, 禽类成髓纤维病毒逆转录酶（AMV酶）42逆转录。25 L PCR反应体系, actin为内参照。扩增参数: 94 5 min; 94 40 s, 56(GRP78)/50(GRP94)/52(TLR4) 40 s, 72 90 s, 35循环; 72 5 min。DL 2 000 marker确定PCR产物大小, 电泳。置凝胶电泳处理系统（YLN2000）成像, Tanon Gis2.0软件半定量分析GRP78/actin、 GRP94/actin、 TLR4/actin灰度比值。1.2.6 蛋白质抽提及Western blot分析肾组织加10 g/L TritonX100蛋白裂解液匀浆, 离心, 弃沉淀, 上清液冰磷酸盐缓冲液漂洗3次,离心, 弃上清液, 加50 L 95 2laemmli SDS（十二烷基硫酸钠）缓冲液, 将样本放沸水振荡水浴5 min, 100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。将蛋白转到尼龙膜上, 将膜放入含50 mL/L脱脂牛奶的TrisHCl缓冲液37孵育1 h。更换新鲜50 mL/L脱脂牛奶Tris缓冲液（TBS）, 加入山羊抗大鼠GRP78（12 000）/GRP94（12 000）/TLR4(12 000)、 GADPH（13 000）mAb, 37孵育2 h, 10 mL/L脱脂牛奶TBS溶液洗膜4次, 每次15 min, 分别加入过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG（12 000）室温振荡孵育1 h, 压片、 定影、 显影、 洗片。Tanon Gis2.0软件半定量分析GRP94/GADPH、 TLR4/GADPH灰度比值。1.2.7 统计学处理计量资料以xs表示, 用SPSS10.0统计软件包进行方差分析、 配对t检验, P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 肝肾综合征模型的评价BDL组各时间点大鼠的肝脏、 肾脏质量均较Sham组明显增加（P<0.05）。组织病理结果表明, BDL组在术后第4、 6周出现典型的肝硬化表现; Sham组各时间点均无假小叶形成; 两组大鼠术后各时间点肾组织无明显病理变化。BDL组术后各时间点ALT、TBI含量均较Sham组明显升高（P均<0.05）; 术后1周、 2周BDL组BUN、 CRE含量无明显变化（P>0.05, vs Sham组）, 但在4、 6周却明显升高（P<0.05, vs Sham组）。结果见表1。表1 BDL组、 Sham组术后组织及生化结果（略）2.2 血浆TNF含量BDL组大鼠术后血浆TNF含量逐步升高, 且4、 6周较1、 2周明显升高（P<0.01）, 但1、 2周间却无统计学意义。Sham组术后各时间点间血浆TNF含量无明显变化。BDL组大鼠术后各时间点血浆TNF含量均明显高于Sham组（P<0.01, 表2)。表2 BDL组、 Sham组术后血浆TNF含量（略） 2.3 肾组织GRP78、 94及TLR4 mRNA的表达Sham组假手术刺激后, 肾组织稳定表达GRP78、 94 mRNA; 而BDL组仅轻度表达, 尤其4周、 6周出现肝硬化及肝肾综合征后表达较Sham组明显减少（P<0.01）。两组术后各时间点均有TLR4 mRNA表达, 但BDL组各时间点均明显高于Sham组（P<0.01, 表3)。表3 BDL组、 Sham组肾组织GRP78、 94及TLR4 mRNA的表达（略）2.4 肾组织GRP78、 94及TLR4蛋白的表达Western blot方法检测到肾组织GRP78、 94及TLR4蛋白表达变化类似于其mRNA表达变化, 即BDL组肾组织GRP78、 94轻度表达, Sham组持续高表达, 而TLR4蛋白表达结果却相反。统计分析表明, BDL组各时间点GRP78、 94表达均明显低于Sham组（P<0.01）, 而TLR4表达却明显高于Sham组（P<0.01, 图1、 2)。3 讨论 GRP是在应激状态下细胞内质网明显表达的一类应激蛋白, 是热休克蛋白（HSP）家族的重要组成部分。近年来对应激蛋白的研究侧重于HSP, 而使GRP研究受到忽视, 但在缺血、 缺氧、 感染等病理情况下, 细胞修复和创伤反应所需的很多蛋白质需要GRPs的调理才能成熟为功能蛋白。GRP78又名免疫球蛋白重链结合蛋白, 是一重要的内质网分子伴侣。内质网应激时, GRP78表达增多可促进蛋白质的折叠及抗细胞凋亡和抑制炎性应答等作用。GRP94又称Gp96, 可特异性结合抗原提呈细胞(APC)表面的gp96受体, 参与抗原提呈和T细胞激活。因此, GRP可作为免疫佐剂或抗原肽载体调节免疫应答。 关于GRP78 和GRP94的表达调控机制, 普遍认为是由细胞内未折叠蛋白反应所介导的转录水平调控。因此, GRP78 和GRP94的表达应是“步调一致”。目前国内外文献中有不少关于GRP78、 94表达的研究报道, 如在CCl4诱导的肝硬化小鼠模型中肝组织GRP78 蛋白和mRNA 表达明显增高3; 烫伤能增强肝脏、 皮肤GRP78表达, 而脾、 肾、 脑、 肺和肌肉内表达无明显变化4; GRP78能保护肾小管上皮细胞损伤;鼠脑发育过程中GRP78、 GRP94的表达在时间和空间上呈现出明显差异5 。但GRP在肝肾综合征肾组织中的表达及作用目前尚无研究报道。我们用胆管结扎术成功建立了SD大鼠肝肾综合征模型, 在BDL组和Sham组的肾组织GRP78、 94无论是mRNA还是蛋白表达变化均表现为一致。 近来研究发现, 内质网应激蛋白可作为“危险信号”被TLR识别而启动内源性炎性信号通路6。但不同部位内质网应激蛋白功能不一样, 细胞内内质网应激蛋白一般起保护作用, 如抗凋亡、 抑制基因表达、 调节细胞周期性增殖及抗炎等活性; 细胞表面内质网应激蛋白能特异结合NK细胞; 而释放到细胞外的内质网应激蛋白能特异地与APC上的TLR2/TLR4结合而具有免疫调节功能, 如增强黏附分子、 协同刺激分子表达, 促进细胞因子、 趋化因子释放。我们在前期研究中发现1, BDL组各时间点肾组织HSP72 mRNA 及其蛋白表达均明显低于Sham组, 而TLR4 mRNA 及其蛋白表达量却显著高于Sham组, 提示肾组织HSP72表达减少可能有助于TLR4炎性信号通路激活, 并可能与肝硬化并发的肝肾综合征发生相关。在本实验中我们进一步观察到, 胆管结扎组大鼠各时间点血浆TNF含量及肾组织TLR4 mRNA、 蛋白的表达均明显高于Sham组表达量（P<0.01）, 即在肝肾综合征发生过程中, 在肾组织GRP78、 94表达下降的同时, 却伴随有TLR4高表达和TNF的高分泌。这些结果提示: (1)GRP78、 94的表达下降可能促进了TLR4的合成; (2)与肾缺血再灌注损伤类似, 炎性损伤也是肝肾综合征发病机制之一; (3)增强肾组织GRP78、 94表达可能有助于预防或减弱肝肾综合征的发生。由于内质网应激蛋白与TLR启动的炎性信号通路关系的研究尚处于起步阶段, 不同内质网应激蛋白可能由不同TLR或其复合物识别, 尚需更多的实验以明确内质网应激蛋白调控TLR炎性信号通路中各分子表达的确切机制。【参考文献】 1晏春根, 朱冬芳, 王 锋. 热休克蛋白72和Toll样受体4在肝肾综合征大鼠肾组织中的表达及作用研究J. 中国危重病急救医学, 2007, 19(12): 705-708.2晏春根, 任光圆, 朱冬芳, 等. 同型半胱氨酸介导的内质网应激对肝细胞脂质代谢的影响J. 中国病理生理杂志, 2007, 23(12): 2414-2418.3王晓红, 张卫光, 林胜利, 等. 四氯化碳诱导性肝硬化大鼠肝组织葡萄糖调节蛋白78表达的研究J. 解剖学报, 2006, 37(3): 290-293.4傅颖珺, 谢 勇, 石俊强, 等. 严重烧伤大鼠脾脏Toll样受体4表达及其与CD4+CD25+调节性T细胞的关系J. 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23(6): 523-526.5Jia Z, Person MD, Dong J, et al. Grp78