重组DNA技术20110413分子生物学.ppt

重组DNA技术 (DNA克隆或分子克隆) DNA Recombination Technique ( DNA Cloning or Molecular Clone),第二章,1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验:,从S型细菌中分别抽提出DNA、蛋白质和荚膜物质，并把每一种成分同活的R型细菌混合，悬浮在合成培养液中。结果发现只有DNA组分能够把R型细菌转变成S型细菌,重组DNA技术的发展史,O. T. Avery（1944年）证明，遗传信息的携带者是DNA； 1953年, Watson和Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型 1958年,Meselson和Stahl证实了DNA的半保留复制 同年， Crick提出遗传信息传递的“中心法则” 1961年， F. Jacob和J. Monod提出了操纵子模型 1966年，Nirenberg等人破译了氨基酸的64个遗传密码 1972年，P. Berg等率先完成DNA体外重组(诺贝尔化学奖) 1973年，S. Cohen等进一步实现了重组DNA的转化 1977年 美国南旧金山建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年，第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1982年，美国FDA批准首例基因工程产品-人胰岛素 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。,人体生长激素释放激素(SS),抑制和调节多种激素的作用,相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系,主要内容：,第一节、重组DNA技术相关概念 Concept Associated to Recombinant DNA Technology,克隆(clone):是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的群体,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一） DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）,是在体外将不同来源的特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或其它载体分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子(recombinant DNA, chimera DNA） ，即DNA克隆，因此DNA重组技术又称为DNA克隆（DNA cloning）。,DNA克隆,生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学或重组DNA技术(recombination DNA technique)，基因操作(gene manipulation)、遗传工程(genedc engineering)。,(二)目的基因,进行DNA重组的目的主要有两方面： 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 这些使我们感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因(target DNA)。 目的基因有两种类型： cDNA(complementary DNA):在体外经反转录合成的与mRNA互补的DNA。 基因组DNA(Genomic DNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。,(三)载体,一.表达载体(expression vector): 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 二.克隆载体(Cloning vector): 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,第二节 重组DNA技术操作的基本过程,基本原理,重组DNA技术操作过程可形象归纳为：,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程,第三节 重要的工具酶,一.限制性核酸内切酶(restriction endonuclease),限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,定义：,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,、（基因工程技术中常用型）,分类：,型限制性核酸内切酶的作用特点 回文结构(palindrome) 大部分型限制酶能够识别由4个8个核苷酸组成的特定序列。型酶识别具有回文结构的核苷酸序列（图2-2）。“回文”意为顺读和倒读都一样的词语,切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同功异源酶：,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,同尾酶,限制性内切核酸酶,二、DNA连接酶(基因工程的“缝纫针”) ： 1. T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6mol/L)或平末端(Km=50mol/L)。 DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导 2. 大肠杆菌DNA连接酶:不能催化平末端DNA分子的连接 三、DNA聚合酶 1.大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段): 大肠杆菌DNA聚合酶I具有三种酶活性。 Klenow片段具有二种酶活性（去除5 3外切酶活性）。 2. Taq DNA聚合酶: 耐热（75-80），分子量65kD,也具5 3外切酶活性。 反转录酶(RDDP):多功能酶，无3 5DNA外切酶活性，具有3 5RNA外切酶活性。,第四节 常用载体,定义 载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。具备的条件: 具有自主复制能力 有多个单一限制性内切酶的酶切位点（MCS） 具有选择性遗传标记 分子量小 拷贝数高（10个200个/细胞） 具有较高的遗传稳定性。,常用载体: 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA,EcoR Sac Kpn Sma BamH Xba Sal Pst Sph Hind ,ori,pUC19质粒载体图,质粒 (plasmid):是细菌内携带的染色体外的小型双链环状DNA，能独立进行复制。,特点: 1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自主复制；有较高的拷贝数。 2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。 3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。,常用质粒载体,（一） pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点： （1）含有复制起始点和复制调节信号； （2）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因； （3）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因 Amp+，便于重组体细胞的筛选。,1.抗药性标记选择,（二） pUC系列载体:,由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点： 具有更小的分子量和更高的拷贝数。 “蓝白斑”筛选: pUC载体中的LacZ基因可编码-半乳糖苷酶（-Gal）N端的-肽链，该-肽与宿主细胞(如E.coli JM109）中F因子上的LacZM15基因（-肽缺陷型）的产物互补，产生完整的、有活性的-半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成蓝色菌落。当外源基因插入MCS后，LacZ-肽基因的读码框被破坏，不能合成完整的-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。称为“蓝白斑”筛选。,EcoR Sac Kpn Sma BamH Xba Sal Pst Sph Hind ,ori,pUC19质粒载体图,3根据-半乳糖苷酶显色反应筛选 :标志补救,第五节 目的基因的获取和体外重组,化学合成法：较短的基因（60-80bp） 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR),一.目的基因的获取:,1.化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,较短的基因（60-80bp） 用途：PCR引物, 测序引物, 定点突变, 核酸杂交探针,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,2.从基因组DNA文库获取目的基因,基因组DNA(genomic DNA):指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列,构建基因组DNA文库的基本过程,3. 从cDNA文库获取目的基因,cDNA:指经反转录合成的、与RNA (mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA,基因组文库和cDNA文库的比较,PCR技术的基本过程,模板DNA dNTP 引物 Buffer,预变性,模板DNA dNTP 引物 Buffer,TaqDNA聚合酶,循环仪,94oC5,94 55 72 ,4.PCR技术获取目的基因:,二.外源基因与载体的连接:体外重组,DNA体外重组本质上是一个酶促反应过程，在DNA连接酶的催化作用下，将外源DNA分子与载体DNA分子连接成一个重组分子的过程。 连接方式: （一）黏性末端连接 （二）平末端连接 （三）同聚物加尾连接 （四）人工接头连接 （五）T-A克隆,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,同一限制酶切位点连接,1.粘性末端连接,不同限制酶切位点的连接,2.平端连接,DNA连接酶,同聚物尾巴,同聚物加尾法连接重组DNA分子,同聚物加尾连接:在末端转移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,利用人工合成的接头连接重组DNA分子,4.人工接头(linker)连接:由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接,5.T-A克隆,T-A克隆策略是一种直接将PCR产物插入到载体中的方法。,一、重组DNA分子的导入 选定的受体细胞应具备的条件： 1. 易于接纳重组DNA分子导入； 2.对载体的复制、扩增和表达无严格限制； 3.不存在特异性降解外源DNA的酶系统；不对外源DNA进行修饰；能表达重组体分子所提供的某种表型特征。 常用的导入方法: （一）转化（transformation） （二）转染（transfection） （三）感染（infection）,第六节 重组DNA分子的导入和筛选与鉴定,转化方法：,1.氯化钙法：细菌处于低温、低渗CaCl2溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组DNA易进入 2.电穿孔法：除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等参数。,特殊处理,受体细胞,细胞膜特性改变,（一）转化（transformation）,CaCl2处理,受体细菌,50-100mmol/L,CaCl2,感受态细菌,重组体转入细菌,（二）转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法： 磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 :操作简单且转染效率高，几乎可转染任何细胞用于瞬时表达或稳定表达。但是它需要专门仪器，确定最佳实验条件。 脂质体转染 :脂质体（liposomes）是一种人造类脂膜.用脂质体包裹DNA，瞬时表达和稳定表达，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大，昂贵。 显微注射:转染效率高，但需要一定的仪器和操作技巧。主要用于稳定表达,（三）感染（infection）,感染是指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组体DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体颗粒和病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA注入细菌或真核细胞。 感染的效率很高，但重组体DNA需经过较为复杂的体外包装过程。,(一）根据重组载体的遗传表型进行筛选 1根据载体的抗药性标记筛选 2根据载体的抗药性标记插入失活选择 3根据-半乳糖苷酶显色反应筛选 4根据插入的外源基因性状进行筛选 (二）限制性核酸内切酶酶切鉴定 （三）核酸分子杂交法 （四）PCR法 （五）免疫化学检测法 （六） DNA序列检测：,二.重组体的筛选与鉴定,1.抗药性标记选择,Ampr,Tetr,BamH位点,BamH酶切,BamH酶切,DNA连接酶,目的DNA,重组质粒,大肠杆菌,含Amp平板,含Amp平板,含Tet平板,2.抗药性标记插入失活选择,3根据-半乳糖苷酶显色反应筛选 :标志补救,4根据插入的外源基因性状进行筛选,如把酵母基因组DNA随机切割后插入到质粒载体中，然后将重组质粒转化到组氨酸缺陷型大肠杆菌细胞中，并在无组氨酸的培养基中培养。这样只有含酵母组氨酸基因并获得表达的转化菌才能在无组氨酸的培养基中生长。,（二）.限制性核酸内切酶酶切鉴定,凝胶电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的PCR扩增片段,原位杂交,（三）.核酸分子杂交法:菌落杂交筛选法,（四）.PCR法,某些载体的MCS两侧存在保守的序列，如pGEM系列载体的MCS两侧是T7及SP6启动子序列，可根据此序列设计引物，对提取的重组质粒进行PCR扩增。 如果已知目的基因的全序列或其两端的序列与全长，可设计合成一对引物，以转化菌的质粒DNA为模板进行PCR扩增，若PCR产物与目的基因的预期长度相一致，那么即可初步筛选出含重组体的阳性菌落。,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,（五）.免疫化学检测法,（六）.DNA序列检测,标准：选择标志，强启动子 ，翻译调控序列，多接头克隆位点 外源基因在原核细胞中的表达： 1融合型表达蛋白 所谓融合型表达是指将外源目的基因与另一基因相拼接构建成融合基因进行表达。 2非融合型表达蛋白 3分泌型表达蛋白 利用分泌型表达载体，需要在信号肽的帮助下进行。4包涵体,1. 原核表达体系,第七节 克隆基因的表达,E.coli表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济,2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）,真核表达载体大多是穿梭载体, 通常包括以下元件：,1启动子 包括SV40、CMV、RSV及LTR等。 2增强子 3剪接信号 4终止信号和PolyA化信号 5遗传选择标记 ：胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等。,新霉素抗性选择系统 新霉素的类似物G418（geneticin）对真核和原核细胞均有毒性。表达载体中携带的neor基因编码的磷酸转移酶能使G418失活，所以当真核细胞中导入了含neor基因的载体后，转染细胞就可以在含有G418的培养基中生长而得以筛选。该选择系统适用于所有真核细胞。,重组DNA技术与医学 的关系非常密切并前景远大,DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective,重组DNA医药产品,重组DNA技术操作的主要步骤,一、A型题：,1以质粒为载体，将外源基因导入受体菌的过程称为： A转化 B转染 C转导 D转位 E感染 2最常用的筛选转化细菌是否含有质粒的方法是： A营养互补筛选 B抗药性筛选 C免疫化学筛选 D原位杂交筛选 ESouthern印迹筛选 3.互补筛选属于： A抗药性标志筛选 B酶联免疫筛选 C标志补救筛选 D原位杂交筛选 E免疫化学筛选 4. 溶原菌是指： A整合了噬菌体基因组的细菌 B整合了质粒基因组的细菌 C含有独立噬菌体基因组的细菌 D含有独立质粒基因组的细菌 E含有独立噬菌体和质粒基因组的细菌,5 理想的宿主细胞不应有下列哪种特点： A易接纳重组子 B对载体的复制扩增无严格限制 C不存在特异的限制酶体系以降解外源DNA D不