酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项.ppt

酶联免疫吸附试验（ELISA）手工操作注意事项,酶免疫测定类型,这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均相酶免疫测定,非均相酶免疫测定,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,ELISA原理（以一步法双抗体夹心法测抗原为例）,ELISA其原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。,影响酶联免疫测定的因素较多, 诸如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、孵育温度的控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等一系列问题均有可能对试验结果产生很大的影响, 只有避免了这些因素, 才能保证试验结果的准确性和可靠性。,一、移液枪的使用,1. 样品准备,（1） 吸样之前要保证移液枪、枪头和液体处于相同温度。置于冰箱保存的样品应提前取出，室温放置，使温度平衡后再吸样。 液体温度 吸头温度的 移取的液体体积会 偏大 液体温度 吸头温度的 移取的液体体积会 偏小 （2） 若溶剂瓶中液体太少，可倒入EP管中，方便吸取。,2. 体积设定,大体积 小体积 逆时针 精度最佳 小体积 大体积 顺时针 调至超过设定刻度，再回调 可保证最佳的精确度,严格的精确调节方法,3. 装枪头,将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可,上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散， 甚至会导致调节刻度的旋钮卡住,4. 吸液,（1） 垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2-4mm以下。 （2） 枪头吸嘴预润湿（2-3次），使吸嘴内壁液体吸附达到饱和，再吸入样液，最后打出液体的体积会很精确。 一般液体，正向吸液（一档二档）。 粘稠液体和易挥发液体，可反相吸液（二档一档）。,正向吸液,反向吸液,（3） 缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度。吸液速度太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确和腐蚀枪体。 （4） 吸取后将移液枪提离液面，停约一秒钟，观察是否有液滴缓慢地流出。若有流出，说明有漏气现象（原因有：枪头未上紧；枪头不匹配；移液枪内部气密性不好）。 （5） 吸嘴外壁残留液滴可沿壁靠去或用滤纸蘸擦。,5. 放液,（1） 将吸嘴口贴到容器内壁并保持10-40倾斜。 （2） 平稳地把按钮压到一档，停约一秒钟二档，排出剩余液体。排放致密或粘稠液体时，压到一档后，再多等一两秒钟二档。 （3） 压住按钮，同时提起移液器，使吸嘴贴容器壁擦过。 （4） 松开按钮。 （5） 按弹射器除去移液嘴。 （6） 使用完毕。,移液枪的养护及注意事项,吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。 移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。 不得用移液枪移取有腐蚀性的溶液，如强酸、强碱等。 如有液体进入枪体，应及时擦干。 千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏移液枪。 移液枪长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，保持松弛状态，延长移液枪的使用寿命。 应定期对移液枪进行校准。,二、ELISA具体操作,1 标本的收集和保存 2 试剂的准备 3 加样本及反应试剂 4 温育 5 洗板 6 显色 7 比色 8 结果判断,1 标本的收集和保存,未抗凝血标本离心前一般令其自行凝集，不可用木棍等剥离凝血块。通常于室温（2025）放置3060min，血标本可自发完全凝集，析出血清；或37水浴2030min，析出血清。 以3000r/min转速离心510min，使血清分离完全。 若过早离心，分离不全，血清中会残留部分纤维蛋白原，吸附于反应微孔，并且不易洗去，可与酶标记物非特异性结合，造成假阳性。,1 标本的收集和保存,（1）要注意避免出现严重溶血、脂血标本。 血红蛋白中铁卟啉具有类似过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的ELISA测定中，如标本溶血，血清中血红蛋白浓度较高，则其很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的底物反应，从而产生非特异性显色。 脂血标本血清中大量的脂质小粒易黏附于反应孔内壁，非离子型洗涤剂(如乳化剂OP)难以洗去，易产生非特异性吸附干扰。,1 标本的收集和保存,（2）血清标本宜在新鲜时检测，要注意尽量避免细菌污染。 血清标本如在冰箱中保存过久，IgG可发生聚合，AFP可形成二聚体，使本底加深，产生假阳性反应。 细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；一些细菌的内源性酶可对以相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。,1 标本的收集和保存,（3）冰冻保存的标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。 标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻结样本溶解后，蛋白质局部浓缩、分布不均，应上下颠倒轻缓混匀，避免气泡，不要在混匀器上强烈振荡。 反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰冻保存。,2 试剂的准备,试剂盒成分： 常用的固相载体（ELISA板孔）材质：聚苯乙烯、聚氯乙烯，具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值底，各板之间、同一板各孔之间性能相近。包被抗原或抗体与聚苯乙烯固相载体通过疏水基团作用物理吸附结合。 常用的酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 洗液：非离子型洗涤剂 酶反应的底物： H2O2，为受氢体； 显色剂：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS，为供氢体。 终止液为硫酸。,2 试剂的准备,（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出，在室温下放置30分钟以上，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了缩短升温时间，使反应孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。 （2）试剂盒中的洗涤液如需在使用时对所提供的浓缩液稀释配制，稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。,3 加样本及反应试剂,在ELISA实验中一般有3次加样步骤，即加标本、加酶结合物、加底物和显色剂。 加样必须注意的关键点是： （1）加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样时如有气泡，抗原抗体不能有效地结合会导致弱阳性甚至假阴性。 （2）每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染。有些测定需用稀释的血清，应保证稀释液与血清混合均匀。 （3）加酶结合物、加底物，应使加液量准确均一、加液过程迅速完成。也可使用试剂盒提供的滴瓶直接滴加。滴加时，除了要注意滴加的角度垂直、一致外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象。,4 温育,温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。 ELISA属于固相免疫测定，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异性抗体或抗原完全结合，必须在一定温度条件下反应一定的时间。一般温育所需时间与温度成反比，即温度越高，所需时间相对较短。最为常用的温度有37和室温(2025)，其次是43和28，目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间通常为373060分钟。 关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点：,（1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。 一般来说，加完样本或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成在实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。 为保证37下足够的温育时间，实验室水浴状态应保证微孔板底贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应贴片或封盖。,（2）温育温度的选择。 在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37下1小时，另一种则为43下45分钟。从免疫测定抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全，产物最稳定。如28下反应24小时。较高的反应温度，由于分子运动的加快，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此，如须选择反应条件，建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温度较长反应时间的条件。,（3）“边缘效应”的排除。 以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温置于37温箱(非水浴)，板孔升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。 而将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，可使温度迅速平衡。让反应板飘浮在水面上。就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。,5 洗板,洗涤在ELISA虽不是一个反应步骤，但也决定着实验的成败。ELISA就是靠洗涤清除残留在板孔中没能与固相抗体（抗原）结合的物质，以及在反应过程中非特异性的吸附于固相载体的干扰物质，以保证ELISA测定的特异性。 洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。 在实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。为保证微孔板的均一性使结果准确可靠，最好选用洗板机洗板。若手工洗板，要注意浸泡时间和孔间洗液最好不要互相流动。流水冲洗法让水流冲击板孔表面，简便、快速，洗涤效果较好。,6 显色,在以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中，一般显色反应条件为37或室温反应1530分钟。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。TMB （四甲基联苯胺）经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后可完全消退至无色。 TMB的终止液有多种，酸性终止液（硫酸）会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。,7 比色,ELISA的比色测定由酶标仪进行。此处强调以下几点： （1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在1530，使用前先预热仪器1530分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应详细阅读说明书。 （2）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。 （3）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。,（4）单波长或双波长比色选择的问题。 所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定； 而双波长比色则在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非敏感波长下的吸光度值的差值。 因此，双波长比色测定具有能排除由微孔板本身、板孔内标本的非特异性吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色干扰的优点。,8 结果判断,临床ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。 定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示；定量测定，每批测试均须用一系列不同浓度的标准品在相同的条件下制作标准曲线。,产生非特异性显色的原因,试剂盒因素：固相载体原料的不同和制作工艺的差别、包被物的提纯度、固相载体表面未被包被的空隙封闭不良等； 人为因素：加样、洗板、温育、判断结果中的操作不当或责任心不强等造成假阳性或假阴性； 标本中含有干扰物： 1.内源性干扰物包括类风湿