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表达结核分枝杆菌ESAT6 作者：张海1，师长宏1，王丽梅2，薛莹2，柏银兰2，徐志凯【关键词】 分枝杆菌,结核；疫苗,DNA；ESAT6；CFP10；融合蛋白；免疫原性Immunogenicity of DNA vaccine expressing ESAT6CFP10 fusion protein of Mycobacterium tuberculosis【Abstract】 AIM: To evaluate the humoral and cellular immune response induced by the DNA vaccine expressing ESAT6CFP10 fusion protein and to test its protective efficacy against Mycobacterium tuberculosis(MTB) challenge. METHODS: BALB/c mice were immunized intramuscularly three times with 100 g recombinant plasmid pcDNAe6c10. Two weeks after last immunization, the specific antibody titer and the stimulation index(SI) of spleen lymphocytes from the immunized mice were measured, and the levels of IFN and IL2 and the activity of antigenspecific CTL were detected. The DNA vaccinevaccinated BALB/c mice were infected with 1105 CFU(colony forming unit) MTB H37Rv through tail vein. Four weeks later, the bacteria load in spleen was determined. RESULTS: The titer of serum specific antibody in BALB/c mice immunized with DNA vaccine was 1800. The SI of DNA vaccineimmunized groups(2.420.13) was significantly higher than that of salineimmunized group. The IFN(244912) ng/Linduced by DNA vaccine was not different from that in bacillus calmette guerin(BCG)immunized group, while IL2(19816) ng/L induced by DNA vaccine had significant difference from that of salineimmunized group and was lower than that of BCGimmunized group. The antigenspecific CTL efficacy was 42%. Compared with the saline immunized mice (bacteria load was 6.510.13), a dramatic reduction of MTB replication was observed in the spleen (bacteria load was 4.510.23, P<0.05) of BALB/c mice immunized with DNA vaccine following a subsequent challenge, but the protective efficacy of DNA vaccine was lower than that of BCG vaccine. CONCLUSION: DNA vaccine expressing ESAT6CFP10 fusion protein has a immunotherapeutic effect to prevent tuberculosis.【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis; vaccines, DNA; ESAT6; CFP10; fusion protein; immunogenicity【摘要】 目的： 研究表达结核分枝杆菌ESAT6CFP10融合蛋白DNA疫苗在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对结核分枝杆菌（MTB）感染小鼠的保护能力. 方法： 以100 g重组质粒pcDNAe6c10接种BALB/c小鼠腓前肌，共免疫3次. 末次免疫结束2 wk后，检测免疫小鼠特异性抗体滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤效应以及诱导IFN和IL2水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠以1105 MTB毒株H37Rv经尾静脉进行攻击，4 wk后计数脾脏细菌负荷数，观察免疫小鼠对MTB抵抗作用. 结果： 表达ESAT6CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1800. 淋巴细胞刺激增殖指数为2.420.13，显著高于生理盐水对照组；免疫小鼠诱导IFN含量（244912）ng/L与卡介苗（BCG）组无明显差异，IL2含量（19816）ng/L不及BCG免疫组，但显著高于生理盐水对照组；同时融合蛋白诱导的CTL杀伤率为42. 与生理盐水免疫组（细菌负荷6.510.13）相比较，DNA疫苗免疫的BALB/c小鼠对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有较明显抵抗作用(细菌负荷4.510.23，P<0.05)，但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷无明显减少. 结论： 表达ESAT6CFP10融合蛋白DNA疫苗能在结核病预防中有一定免疫治疗作用. 【关键词】 分枝杆菌，结核；疫苗，DNA；ESAT6；CFP10；融合蛋白；免疫原性0引言研究认为卡介苗（bacillus calmette querin, BCG）可预防并减轻儿童的严重结核病（tuberculosis, TB），但对成人TB的预防作用从0到80不等1. 因此急需研究一种比BCG更好的疫苗来控制该病的传播与蔓延. ESAT6抗原是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）早期分泌性低分子质量蛋白，能诱导机体产生强烈T细胞免疫应答和释放高水平IFN. 许多研究表明ESAT6蛋白具有良好的抗原刺激性并能被大多数TB患者所识别. 近年来又发现另一种低分子质量MTB培养滤液蛋白CFP10，CFP10与ESAT6同属于ESAT6家族，且由同一操纵子调控，与ESAT6相同的是，CFP10也是免疫优势抗原，能诱导机体产生强烈免疫应答2. 为了全面评估表达ESAT6CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫学特性，我们研究了此种疫苗在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答水平，同时测定免疫小鼠对MTB毒株H37Rv攻击的保护力，以了解其对TB的预防作用. 1材料和方法1.1材料pcDNAe6c10重组质粒3由本室构建. MTB H37Rv毒株由陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师馈赠. BCG疫苗株（陕西省生物制品研究所）. 鼠IFN, IL2 ELISA检测试剂盒（深圳晶美生物工程公司），CTL检测试剂盒（Promega公司）. 7H9液体培养基，BCG培养增强剂（albumindextrosecatalase, ADC）（Gibco公司）. 68周龄 BALB/c小鼠80只，雄性（第四军医大学实验动物中心提供），饲养于该中心P3实验室. 1.2方法1.2.1BCG和MTB毒株H37Rv的培养和定量BCG疫苗株接种到7H9液体培养基（含100 g/L ADC 和0.5 g/L Tween80），37振荡培养3 wk，5000 r/min离心10 min，收集细菌，保存于-20备用. 用7H9液体培养基系列稀释浓缩液，接种于罗氏培养基37培养2 wk，计数浓缩液细菌的克隆形成单位（CFU）. MTB毒株H37Rv接种到7H9液体培养基，按以上方法培养、收集，并计数细菌的CFU. 1.2.2MTB 培养滤液蛋白（CFP）的制备取少量MTB H37Rv株接种于7H9液体培养基，37震荡培养3 wk，液体培养物以11 000 g离心10 min，上清液过滤除菌后，加入终浓度为750 g/L的饱和硫酸铵盐析，沉淀溶于PBS. 用大量PBS溶液透析，再次过滤除菌后，紫外分光光度计法计算蛋白含量，用灭菌的PBS调整蛋白浓度为25 mg/L，-20保存备用. 1.2.3重组质粒大量提取将pcDNAe6c10阳性克隆菌接种于5 mL LB液体培养基（含氨苄青霉素0.1 mg/L），37振荡培养过夜. 次日按1100 的比例扩大培养20 h. 质粒的大量提取及纯化按文献4进行. 1.2.4动物免疫实验共分4组，每组20只，第1组以重组质粒pcDNAe6c10免疫，接种前小鼠后肢大腿内侧多点肌注2.5 g/L盐酸布吡卡因50 L，24 h后在一侧同一部位多点注射质粒，50 g /次；以同样的方法每隔2 wk在相同部位注射相同剂量，共免疫3次. 第2组为BCG免疫组，以0.2 mL（1105 CFU）的BCG经尾静脉途径接种小鼠，第3组为生理盐水对照组. 末次免疫结束2 wk后，每组取10只小鼠用于测定淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤效应以及IFN和IL2水平. 另设一组以0.2 mL（1105 CFU）的H37Rv毒株只免疫一次，仅检测其诱导的CTL杀伤效应. 三组免疫接种时间均与DNA疫苗初免时间相同. 1.2.5小鼠血清抗体滴度的检测间接ELISA方法测定免疫小鼠血清中抗ESAT6CFP10融合蛋白特异性抗体滴度. 用MTB CFP 10 g/孔包被酶联板进行检测. 1.2.6脾淋巴细胞的分离与制备将免疫小鼠断颈处死，无菌取脾脏，置于200目的钢网上，以注射器针芯研磨，并加入RPMI1640培养液冲洗，将上述细胞悬液转入2倍体积的淋巴细胞分离液，1000 r/min离心20 min，吸取中间单核细胞层，用RPMI1640培养液洗涤两次后计数. 1.2.7特异性淋巴细胞增殖实验将分离的脾淋巴细胞密度调整至5108/L，在96孔板中用100 mL/L FCS的RPMI1640完全培养液培养，100 L/孔，同时实验组每孔加入25 mg/L ESAT6CFP10纯化蛋白25 L，而对照组不加此纯化蛋白，调零孔不加脾细胞，50 ml/L CO2孵箱培养68 h后每孔加20 L MTT（5 g/L，溶于PBS，pH 7.2，过滤除菌），继续培养4 h后弃上清，加DEMSO 150 L/孔，振荡培养10 min，测定A490 nm值. 结果用刺激指数实验组A490 nm/对照组A490 nm表示. 1.2.8IFN，IL2的诱生及含量测定将5108/L脾细胞滴入96孔板后加入纯化ESAT6CFP10蛋白进行刺激，培养72 h后收集上清，-20冻存备检. 方法参照试剂盒说明（夹心ELISA法）测定各标本所含IFN，IL2浓度.1.2.9CTL活性检测CTL检测采用乳酸脱氢酶（LDH）方法. 先确定靶细胞（稳定表达ESAT6CFP10融合蛋白的P815细胞系）最佳细胞数，将靶细胞按0， 5106， 1108， 2108/L加入96孔板，检测不同细胞数量释放的LDH，最终确定5106/L为最佳细胞数. 试验中同时设立靶细胞最大LDH释放量、靶细胞自发LDH释放量、效应细胞自发LDH释放量、细胞培养液LDH释放量和Volume Correction作为对照，试验组中靶细胞和效应细胞数量分别按15，110，120，150混匀加入. 免疫小鼠脾细胞分离后调整细胞浓度进行CTL检测，具体过程按试剂盒说明书进行.1.2.10MTB H37Rv毒株的攻击实验最后一次免疫完成后2 wk，用MTB毒株H37Rv经尾静脉感染小鼠，剂量为0.2 mL/只（1105 CFU），4 wk后，断颈处死小鼠，脾脏匀浆，接种罗氏培养基培养4 wk，计数细菌CFU. 统计学处理： 实验数据以xs表示，统计分析采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验，P0.05为有统计学意义.2结果2.1免疫小鼠血清特异性抗体滴度DNA疫苗免疫BALB/c小鼠3次后，其血清中的特异性抗体滴度平均为1800. BCG免疫组中只存在抗MTB CFP抗体，不存在抗ESAT6CFP10融合蛋白抗体；同时生理盐水阴性对照组的小鼠血清抗ESAT6CFP10蛋白抗体全部为阴性. 2.2免疫小鼠抗原特异性淋巴细胞增殖DNA疫苗能诱导免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖，其刺激指数为2.420.13，但其诱导淋巴细胞增殖明显不及BCG (3.430.13)，而生理盐水对照组淋巴细胞的增殖不显著，刺激指数为0.900.16. 2.3脾脏淋巴细胞中诱生的IFN水平免疫小鼠脾淋巴细胞悬液在体外用刺激后，IFN含量显著增加，DNA疫苗免疫组为（244912）ng/L，显著高于生理盐水阴性对照组（42916）ng/L，与BCG免疫组（253015）ng/L无明显差别. 2.4脾脏淋巴细胞中诱生的IL2水平DNA疫苗诱导免疫小鼠IL2表达量增加，含量为（19816）ng/L ；而生理盐水对照组只有（5416）ng/L，均低于BCG免疫组（29817）ng/L.2.5特异性CTL杀伤效应DNA疫苗诱导的杀伤活性为42（图1），比生理盐水组和BCG组高，但不及H37Rv组（62）. 图1免疫小鼠脾细胞的细胞毒性活性检测略2.6免疫小鼠对MTB毒株攻击的抵抗作用MTB H37Rv毒株感染免疫小鼠4 wk后，DNA疫苗免疫组脾脏荷菌数(4.510.23)对MTB有一定抵抗力，但不及BCG免疫对照组（4.110.25， P<0.05），高于生理盐水对照组(6.510.13).3讨论在抗MTB感染过程中，DNA疫苗已被证实能诱导持久保护性细胞免疫应答和体液免疫应答. DNA疫苗则可引起强烈的CD8+T细胞反应，诱导产生大量的抗原特异性CD8+/CD4-/CD44high T细胞，分泌IFN，引起有效的细胞免疫5 MTB的分泌蛋白MPT64, Ag85B和ESAT6是DNA疫苗良好的候选抗原，研究发现这些DNA疫苗有较高的保护作用，将三种重组质粒联合免疫动物所诱导的保护作用比单独使用一种质粒结果要好6，提示DNA疫苗未来研制策略有可能向融合型基因疫苗发展. 融合型DNA疫苗可以是抗原抗原融合，也可是抗原细胞因子的融合. ESAT6和CFP10是效应性T细胞的主要靶抗原，可诱导T细胞迅速增殖和释放高水平的IFN，有效地激活巨噬细胞，控制MTB感染. 研究表明单独编码ESAT6的基因疫苗的保护作用比MPT64强，但这两种DNA疫苗的保护作用并未达到BCG的免疫效果7，所以需要加入其他免疫刺激源，如细胞因子或其他保护性抗原，才能取得良好效果. 基于此我们将MTB中两个保护性蛋白融合后构建成具有保护作用的基因疫苗，试图增强基因疫苗的保护效果. ESAT6和CFP10基因仅存在于少数致病性分枝杆菌中，而不存在于BCG及其他非致病分枝杆菌8，因此在BCG免疫小鼠血清未检测到ESAT6和CFP10的抗体. 另外在检测CTL活性时，由于BCG缺失这两个基因，BCG免疫小鼠脾细胞不会产生针对这两种抗原的特异性免疫应答，如以BCG作为融合蛋白诱导CTL活性的阳性对照就不能正确反应重组疫苗的免疫应答水平，因此我们在检测CTL活性时除设立正常BCG免疫组外，又设立了MTB H37Rv毒株免疫组作为阳性对照，以正确评价重组疫苗的CTL活性. DNA疫苗一般要接种3次，BCG临床接种程序为1次，故在保护力实验中，BCG组毒株攻击时间是在初免后6 wk进行，而DNA疫苗组是在末次免疫完后2 wk进行. Th1型免疫应答诱发产生的IFN是控制MTB在体内生长繁殖的重要因素，它可激活单核细胞和巨噬细胞，使其发挥杀菌作用. IFN由活化的Th1细胞产生，能增强巨噬细胞的抗分枝杆菌活性，其机制可能与增加过氧化氢和NO产生有关. 我们的研究发现ESAT6CFP10融合蛋白基因疫苗能诱导较强的细胞免疫应答，诱导的IFN与BCG相比也无明显差距，表明表达ESAT6CFP10融合蛋白的DNA疫苗免疫效果较好，可在TB防治中发挥重要作用. 【参考文献】1Chan J, Kaufmann S. Immune mechanisms of protection in tuberculosis pathogenesis, protection and controlA. Bloom, BR. Ed. American Society of MicrobiologyM. Washington: Kluwer Academic Publishers. 1994:9389-9415.2 Berthet F, Rasmussen P, Rosenkrands I, et al. A myco