迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建、表达及鉴定.doc

迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建、表达及鉴定 作者：秦红，金晓航，黄威权，刘玉林【摘要】 目的 构建、表达及鉴定迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因。方法 采用RTPCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1E11)中克隆出VH和VL可变区基因, 再通过重叠延伸拼接PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3，体外构建单链抗体基因；将其克隆至表达载体pET28a并在大肠杆菌中表达，表达产物纯化后，用SDS PAGE、Western blot及ELASA进行鉴定。结果 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在，经过溶解包涵体、纯化和体外复性，获得了高纯度的单链抗体片段，重组蛋白的分子质量为27ku。ELASA分析结果证实迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv与原代抗体一样，具有较高的抗原亲和力。结论 成功构建了迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv，为进一步制备迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗奠定基础。 【关键词】 迟缓爱德华菌；抗独特型；单链抗体ABSTRACT: Objective To construct, express and identify the antiidiotypic antibody single chain variable fragment (scFv) against Edwardsiella tarda. Methods By using RTPCR method, the variable regions of the heavy and light chain of the antiidiotypic monoclonal antibody (mAb) 1E11 against Edwardsiella tarda were cloned and joined with a (Gly4Ser)3 linker, and the scFv in the orientation of VLlinkerVH was constructed. It was then cloned into vector plasmid pET28a, expressed in Escherichia coli BL21(DE3), and confirmed by SDSPAGE, Western blot and ELISA. Results The recombinant scFv could be expressed in E.coli BL21 (DE3) in a fusion protein pattern. The expression product was in the form of an inclusion body and the purified fusion protein was obtained after being purified and refolded. The SDSPAGE and Western blot analysis showed that the molecular weight of scFv protein was 27ku. Indirect ELISA confirmed that the scFv had the binding activity to the antigen. Conclusion The recombinant antiidiotype scFv has been successfully constructed and expressed in E.coli BL21 (DE3), providing the basis and potential for preparation of genetically engineered vaccine against Edwardsiella tarda.KEY WORDS: Edwardsiella tarda; antiidiotype; single chain antibody迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)是肠杆菌科爱德华菌属中唯一对人有致病性的细菌, 并证实其为条件致病菌。该菌含有长度为5.3kb的溶血素基因，其表达产物为一种热不稳定性蛋白质，具有很强的致病性1。迟缓爱德华菌感染具有暴发性发作的特点，其原发感染或引起的继发感染，对人或鱼类的致病性均较严重2。目前，对该菌的治疗仍然是使用各类抗生素，如在饵料中添加适量的土霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素、呋喃唑酮和磺胺类药物等，但抗生素等易产生耐药性和药物残留，对人类的健康带来危害。 免疫网络学说认为3，针对外来抗原的抗体分子(Ab1)可变区上独特型(idiotype, Id)可刺激机体产生相应的抗Id抗体(Ab2)。其中Ab2具有抗原“内影像”的作用，可模拟抗原诱导机体产生针对始动抗原的特异性抗体或细胞免疫应答，并抑制Ab1与相应抗原的结合反应。针对Ab2的这一特性，研制的抗独特型抗体可代替抗原刺激机体，通过诱导机体的免疫反应建立针对抗原的免疫效应，从而达到预防疾病的目的。我们在前期研究工作中，已成功制备出迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株1E11，可分泌具有抗原“内影像”、高保护率的抗独特型抗体4。但利用细胞工程生产的抗独特性抗体，要经过大量培养分泌抗体的杂交瘤细胞来获取，成本较高，并存在着多次传代后抗体易丢失的缺点。因此，在本研究中，我们应用RTPCR技术从分泌迟缓爱德华菌抗独特型的杂交瘤细胞株1E11中克隆出重链和轻链可变区基因，体外构建单链抗体基因scFv，将其克隆至表达载体pET28a并在大肠杆菌中表达，表达产物经纯化及复性后进行鉴定，成功构建了迟缓爱德华菌抗独特型重组基因工程疫苗。1 材料与方法1.1 菌株、质粒及主要试剂迟缓爱德华菌独特型mAb杂交瘤细胞株1E11为我室建立4。质粒pET28a及菌株E.coli BL21(DE3)为美国Novagen公司产品；RPMI1640为GibcoBRL公司产品；RNA抽提试剂购自TaKaRa公司，RTPCR试剂盒为美国Invitrogen公司产品；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自北京博大泰克公司；PCR试剂和连接试剂均购自北京天为时代公司。变性缓冲液：50mmol/L TrisHCl(pH 8.0)，0.5mmol/L EDTA，5mmol/L DTT，50mL/L甘油。复性缓冲液：25mmol/L TrisHCl(pH 8.0)，10mmol/L NaCl，0.1mol/L脲，10mL/L甘油。梯度透析液A：25mmol/L TrisHCl(pH 8.0)，10mmol/L NaCl，0.05mol/L脲，10mL/L甘油。梯度透析液B：25mmol/L TrisHCl(pH 8.0)，10mmol/L NaCl，0.01mol/L脲，10mL/L甘油。1.2 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建复苏分泌抗迟缓爱德华菌独特型mAb的杂交瘤细胞株(1E11)，传至3代使细胞数目达2.8107/L后收获细胞。用TRIzolTMReagents、氯仿和异丙醇抽提RNA后，以无水乙醇沉淀；以11L RNA为模板，以Oligo(dT)20为随机引物，反转录合成cDNA第1链。PCR引物序列：VL back：5GCAGAAGCTTGCGGCCGCTTATTTTATTTCCAGCTTGGTCCC3；VL for：5ACCGCCGGATCCACCGCCACCCGAGCCACCG CCACCTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC3；VH back：5GGCTCGGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGAGGTTCAGCTG CAG3；VH for：5GCAGAAGCTTGCGGCCGCTTATGAGGAGAGAGTGGC3。在25L反应体系中，加入cDNA 2L、Back和For引物各2L、2Pfu PCR MasterMix 12.5L，ddH2O补至25L进行PCR反应。VH基因扩增的反应参数为：于94变性5min后，94 1min，50 1min，72 1min，共25次循环后，于72再延伸10min。VL基因扩增的反应参数为：94变性5min后，94 1min，52 1min，72 1min，共25个循环，最后72 10min。将PCR扩增的VH和VL基因片段经电泳分离纯化后，以等量(各3L，约1g)混合，加入10Taq Buffer 5L、dNTP 4L和12个单位的Taq聚合酶，加ddH2O补至50L进行PCR反应：于94变性5min后，94 1min，58 1min，72 1min，7次循环后，在反应管中加入scFv基因5端引物和3端引物各1L，再加入1个单位的Taq聚合酶进行30个循环的扩增，即可得到完整的单链抗体scFv基因。PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.3 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的表达、纯化及复性 将单链抗体scFv克隆至原核表达载体pET28a，构建原核表达质粒pET28ascFv。筛选阳性克隆，将鉴定正确的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达：挑取转化的单菌落接种于5mL LB(LuriaBertani)培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L，pH 7.4，含25mg/L卡那霉素)的锥形瓶中，220r/min，37培养过夜，次日以1100转接，37条件下振荡培养至A600=0.40.6，加入IPTG(isopropyl D1thiogalactopyranoside，异丙基D硫代半乳糖苷)至终浓度为0.1mmol/L，1015低温诱导表达4h后收菌。将原核表达产物12000r/min、4离心15min，弃上清，用denature buffer悬浮沉淀，加溶菌酶至100g/mL，30水浴30min，置冰上超声破碎菌体50次(2s/次，间隔2s)。12000r/min、4离心10min，弃上清；加入refolding buffer至20mg/mL，在4条件下，每隔2h加1次，共分3次加入；4条件下1012h，待液体清透后装入处理过的透析袋透析，每隔6h更换一次透析液(先A液后B液，最后加PBS)，3次后收集菌体加入500mL/L甘油，-70冻存。1.4 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的鉴定1.4.1 单链抗体表达产物的SDSPAGE和Western blot分析纯化表达产物用PEG浓缩纯化后取10L加等量的2SDS蛋白上样缓冲液，在沸水中煮10min，12000r/min离心5min后，取10L上清进行SDSPAGE蛋白电泳。电泳完毕后取下凝胶用考马斯亮蓝染色1h，用脱色液脱色13h观察是否有目的蛋白。同样的SDSPAGE电泳凝胶经电转移2.5h，把目的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜(NC膜)，将NC膜用5g/L的脱脂奶粉于37封闭1h，PBST(磷酸缓冲液加Tween20)抗体稀释液洗涤3次，加入1200鼠抗迟缓爱德华菌单克隆抗体，37，1h；PBST洗涤3次，加入150的HRP(辣根过氧化物酶标记)羊抗小鼠IgG，37孵育1h，PBST洗涤3次；DABH2O2显色。1.4.2 单链抗体scFv的特异结合活性的ELISA检测将200尾体重约50g的鲤鱼(Cyprinus carpio L.)随机分成两组，每组100尾。免疫组每尾腹部注射10g纯化的单链抗体蛋白，对照组每尾腹部注射30g纯化的空质粒表达产物。共免疫4周，每周1次。4周后取鱼血清做ELISA检测抗体特异结合活性。将两组鱼血清以不同稀释度包被ELISA板，每孔100L，4过夜，洗涤后加入迟缓爱德华菌抗独特型mAb 1E11(11000)，37孵育1h；洗涤后再加入HRP羊抗小鼠IgG，37孵育1h；PBS快速洗涤5次后OPD显色，酶联检测仪上测492nm的A值。2 结 果2.1 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建和酶切鉴定 PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到大小约为750bp的条带，与预期长度相符(图1)。测序结果证实扩增的单链抗体基因scFv完全正确(图2)。2.2 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的表达、纯化及复性 表达载体pET28ascFv转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，在IPTG浓度为0.1mmol/L条件下，1015诱导4h后，形成无活性的包涵体。对破碎菌体之后获得的包涵体，以低浓度梯度进行了透析和低温条件下复性，获得初步纯化约3mg/mL融合蛋白。2.3 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的鉴定重组融合蛋白的SDSPAGE和Western blot分析显示，在31ku处有一特异性蛋白条带，此蛋白分子量与期望值一致(图3)。说明该诱导蛋白为目的蛋白。ELISA检测结果显示，表达scFv融合蛋白免疫血清中的抗体能与抗原特异性结合(图4)，与对照相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。3 讨 论 在基因工程抗体研究领域中，单链抗体(singlechain FV Fragment, scFv)是研究最多的小分子抗体。scFv是由免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽(linker)连接而成的重组蛋白，它具有完全抗原结合位点的最小抗体片段，大小为完整抗体的1/6。因此，它具有分子小，免疫原性低；组织穿透力强、易于进入血液循环，到达靶细胞；在非靶向组织中滞留时间短、血液清除快；无Fc段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合；易于基因工程操作和通过包涵体大量表达，尤其易于构建与其他效应分子连接的抗肿瘤融合蛋白5等诸多优点。因此，人们已研制了多种单链抗体用于基础医学研究和临床治疗。我们在以前研究的基础上，应用基因工程重组抗体技术，从迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体杂交瘤细胞株1E11中克隆抗体的轻、重链可变区基因，得到的抗体重链可变区VH基因全长339bp，编码113个氨基酸，序列中无终止密码子，为一开放读框；具有4个FR，3个CDR区和维持抗体V区空间结构所必需的2个特征性的半胱氨酸，分别位于第22位和第96位，为VDJ重排，符合小鼠IgGVH基因特征。同源性分析表明，我们所得到的VH基因与GenBank中序列号为M13832.1(Identities 96%)和U88672.1(Identities 93%)序列相似性较高，它们均为小鼠重链可变区基因。确定扩增的VL基因为具有VJ重排，符合小鼠IgGVL基因特征的正确轻链可变区序列，基因全长336bp，编码112个氨基酸，序列中无终止密码子，为一开放读框；具有4个FR，3个CDR区和维持抗体V区空间结构所必需的2个特征性的半胱氨酸，分别位于第23位和第93位，且分别位于FR1区和FR3区。序列相似性最高的两个基因U60463.1和L22331.1均为V可变区基因，经检索GenBank，轻、重链可变区基因均未见相同序列，为两个新基因。在此基础上，我们构建了VLlinkerVH形式的单链抗体scFv基因，并克隆到原核表达载体pET28a中，在原核表达菌株BL21(DE3)大肠杆菌表达。SDSPAGE及Western blotting结果显示，pET28ascFv在接近相对分子量31ku处有一条特异性条带，表明表达的scFv重组蛋白能与抗迟缓爱德华菌单克隆抗体结合，具有亲本抗体的抗原特异结合活性。将表达的scFv重组蛋白免疫体重约50g的鲤鱼(Cyprinus carpio L.)，4周后取鱼血清做ELISA检测抗体特异结合活性。结果表明，血清中的抗体能特异结合迟缓爱德华菌抗独特型mAb 1E11，在110110000浓度梯度下，与对照组相比，ELISA结果具有统计学意义(P<0.01)。单链抗体(scFv)的重链可变区和轻链可变区都可以成为scFv的N端，然而scFv的结合位点可能与V区的顺序明显相关。VHlinkerVL比VLlinkerVH的亲和力高10倍以上，但是VLlinkerVH的表达量比VHlinkerVL高20倍。这是因为虽然VH和VL的氨基酸残基都接近结合位点，但VH的N端更靠近折叠的HCDR3环，根据多克隆抗体结合位点推测，在与抗原的相互结合上，VH的作用比VL大，所以VHlinkerVL的顺序可以减少对scFv结合位点的干扰。但是，有的VL也可以发挥同样甚至更为重要的抗原结合作用6。本研究中，我们应用基因工程重组抗体技术，构建了VLLinkerVH形式的迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv，经原核表达和鉴定，结果显示，我们得到一个分子质量为31ku的特异性单链抗体蛋白，能够模拟抗原的保护性表位，可以用来制备爱德华菌的鱼用疫苗。本研究为进一步制备迟缓爱德华菌真核表达的基因工程疫苗打下了基础。【参考文献】 1CHEN JD, LAI SY, HUANG SL. Molecular cloning, characterization, and sequencing of th