重组人白细胞介素18在原核系统中高效表达的策略.doc

重组人白细胞介素18在原核系统中高效表达的策略 作者：杨京生，田生活，全家妩【摘要】 目的 探索并建立人白细胞介素18（hIL-18）的原核高效表达系统。方法 设计特异性引物，以RT-PCR从外周血单个核细胞中扩增出人白细胞介素18成熟肽片段，克隆进入PBV220载体。以DNAWORK软件和RNADRAW软件进行结构和自由能优化；通过合成寡核苷酸和overlap PCR技术将hIL-18cDNA中的原核稀有密码子定点突变为同义的高频密码子；酶切连接构建原核表达载体并与优化前序列比较它们在宿主菌中诱导表达结果。进而对表达条件进行了优化。表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定。结果 扩增人白细胞介素18成熟肽基因序列测定正确，同时获得氨基酸密码子比例适合于大肠杆菌原核表达的突变型IL18序列。构建的原核表达载体PBV220/mhIL-18和PBV220/ohIL-18在大肠杆菌中获得有效表达，目的蛋白的产量在相同条件下优化型比野生型序列增加达3倍，Western Blot鉴定正确。结论 根据使用的载体/宿主系统，对结构和自由能优化、稀有密码子突变产生影响并能有效提高目的蛋白的表达。 【关键词】 人白细胞介素18；稀有密码子；优化密码子；overlap PCR；表达 High expression of recombinant human IL-18 expression in pronucleus system through optimized condon 【Abstract】 Objective High expression of recombinant human IL-18 expression in E.coli.Methods The yield of combinant human IL-18 expression in E.coli remains quite low because the sequence of mature hIL-18 has 37aa rare condons for E.coli in a total of 157aa. To overcome this problem， gene synthesis was performed with optimized condons for the expression host E.coli through overlap PCR using six synthesis DNA fragments of 95-101 residues having 22-24 residues overlaps.Results The final yield of IL-18 with optimized condons was about three times higher than the yield with the native sequence.Conclusion The application of the above technigue may be increased the goal protein expression effectively. 【Key words】 hIL-18;optimized condon; rare condon; overlap PCR; expression 1995年Okamura等发现用痤疮丙酸杆菌处理的小鼠再用抗CD3单克隆抗体刺激，可释放高水平的IFN-。因其可诱导IFN-的产生，称之为干扰素诱生因子1。IGIF与IL-12在功能上有相似之处， 且在IFN-的诱生上两者有协同效应， 但两者的分泌途径却各不相同。基于IGIF功能上的多效性，将其命名为白细胞介素18。IL-18是18.3kD的蛋白质，它对多种细胞尤其是免疫细胞具有多向性作用，如诱导免疫细胞产生IFN-、增强NK细胞和CTL细胞的活性、促进IL-2介导的T细胞增殖、增强Th1单克隆和富集的多克隆T细胞产生Th1类细胞因子、促进Fas配体（FasL）在T细胞表面的表达、增强Fas介导的细胞毒作用等。IL-18的许多功能与IL-12相似，在某些方面作用甚至更强，因此被认为是一种潜力极大的增强机体抗肿瘤免疫能力、抗微生物、抗自身免疫疾病的细胞因子，目前国外已经完成其一期临床，进入二期临床研究阶段。 IL-18是以非活性的前体形式合成，然后通过白细胞介素 1转移酶（ICE）在天冬氨酸位点上水解， 去除含有36个氨基酸的前导序列， 成为成熟的IL-18而发挥生物学活性。成熟的人IL-18的长度分别为157个氨基酸。它们的分子中没有-糖基化位点， 不存在二硫键，很可能巯基（-SH）就是分子的活性中心。表达产量是影响工程化生产的重要因素之一,通过反转录PCR扩增出人白细胞介素18成熟肽基因片段,将其中的原核稀有密码子突变为高频同义密码子,并进行RNA结构和自由能优化,经筛选,最后获得了高效表达的序列,表达产量在相同条件下比野生型序列增加达3倍。 1 材料与方法2 1.1 质粒和菌株 质粒PBV220、细菌DH5a，由本室保存。 1.2 试剂 Trizol（GIBCO公司），逆转录试剂SuperscriptII（Invitrogen公司），限制性内切酶EcoRI、BamHI、PCR试剂PreMix ExTaq、PCR纯化试剂盒、T4 DNA连接酶试剂Lagation Sol I（TAKARA公司），Anti-hIL-18鼠源单抗（购自晶美公司），羊抗鼠酶标记抗体（Sigma 公司），BCA法蛋白含量检测试剂盒（PIERCE公司），其他化学试剂为分析纯。 1.3 引物的设计和合成 用于扩增野生型IL-18的引物3： 上游引物P1：5CGGAATTCATGTACTTTGGCAAGCTTGAATC 3（含EcoRI位点） 下游引物P2：5CGGGATCCTTAGTCTTCGTTTTGAACAG3 （含BamHI位点） 用于扩增优化型IL-18的引物： 上游引物P3：5CGGAATTCATGTACTTCGGTAAACTGGAATC 3（含EcoRI位点） 下游引物P4：5CGGGATCCTTAGTCTTCGTTCTGAACGG3（含BamHI位点） 用于密码子优化的寡核苷酸链： 寡核苷酸链O1：5TACTTCGGTAAACTGGAATCTAAGCTGTCCGTTATCCGTAACCTGAATGAC CAGGTACTGTTTATTGATCAAGGCAACCGCCCGCTGTTCGAGGACATG 3 寡核苷酸链O2：5CGAGGCTGGGAGTCTTTATACATAGAGATAATA AAGATAGTGCGTGGAGCG TTATCACGGCAGTCGCTATCGGTCATGTCCTCGAACAGCGGGC 3 寡核苷酸链O3：5GTATAAAGACTCCCAGCCTCGTGGTATGGCAGTGACGATTAGCGT CAAGTGT GAAAAAATCTCTACCCTGTCCTGCGAAAACAAGATTATCAGCCTC 3 寡核苷酸链O4：5CCCGGAACGGAGCGCTGGAAAAAGATGATATCAGATTTAGTGTCTTTAATGT TATCCGGCGGGTTCATCTCTTTGAAGCTGATAATCTTGTTTTCGC 3 寡核苷酸链O5：5CCAGCGCTCCGTTCCGGGCCACGACAACAAAATGCAGTTCGAAAGCTC TTCCT ACGAAGGTTACTTCCTGGCGTGTGAAAAAGAACGTGATCTGTTC 3 寡核苷酸链O6：5GTCTTCGTTCTGAACGGTGAACATGATAGAACGATCGCCCAGTTCGT CTTCT TTTTTCAGGATCAGTTTGAACAGATCACGTTCTTTTTCAC 3 引物经oligo软件验证，寡核苷酸链经DNAWORK软件（http：//dnaworks/dnaworks2.html）验证，由上海生工合成。 1.4 野生型IL-18表达载体的构建 人外周血单个核细胞提取总RNA采用Trizol一步法，RT:4260min。PCR扩增采用P1P2引物，预变性945min；变性94 30s，退火5 30s，延伸70 50s；共30个循环。DNA回收按试剂盒方法进行。DNA片段经EcoRI，BamHI双酶切后插入同样双酶切的PBV220载体按连接试剂盒说明进行，称PBV220/mhIL-18。 1.5 密码子优化 以DNAWORK软件和RNADRAW软件进行RNA结构和自由能优化；设计合成寡核苷酸将mhIL-18cDNA中的原核稀有密码子定点突变为同义的高频密码子。采用overlap PCR技术，通过两轮PCR，第一轮采用O1O6，95 1min，65 1min，72 1min，共10个循环；第二轮采用P3P4，以第一轮产物为模版，95 热变性7min，然后951min，65 1min，72 1min，共40个循环，最后72延伸10min。同前方法插入PBV220载体，称PBV220/ohIL-18。 1.6 重组子的挑选、酶切和测序鉴定 将连接产物转化DH5a感受态菌，以氨苄琼脂糖平板筛选，挑取克隆培养过夜，小量提取质粒进行EcoRI、BamHI双酶切鉴定。鉴定的阳性克隆送上海生工公司测序。 1.7 重组子诱导表达及含量测定 将测序鉴定正确的两克隆分别30过夜培养，按1：50加入100mlLB（amp）中，培养4h，将温度升至42，诱导表达4h。超声破菌提取包涵体，经8M尿素溶解后SDS-PAGE鉴定。BCA法测定蛋白质含量方法按试剂盒说明进行。 1.8 诱导表达的条件优化 野生型重组子分别采用amp浓度为50g/ml、100g/ml、200g/ml的LB培养基及1：20、1：50的接种比例进行诱导表达，包涵体经8M尿素溶解后SDS-PAGE鉴定。 1.9 表达产物的Western Blot鉴定 参照分子克隆手册进行，其中WB鉴定所用一抗为Anti-hIL-18鼠源单抗，二抗为羊抗鼠酶标记抗体。2 结果 2.1 RT-PCR扩增野生型IL-18基因 以P1和P2为引物扩增产物的预期长度为493bp。扩增产物用琼脂糖电泳分析，图1可见扩增的产物DNA片段与设计预期的相同。 2.2 overlap PCR扩增优化的IL18的DNA序列 经过两轮PCR，图2可见在500bp处有一条亮带，与预期的结果相符。其下有几条暗带，考虑是6条寡核苷酸链之间的非特异性扩增所致。 2.3 重组子酶切鉴定 两种阳性克隆分别用EcoRI，BamHI双酶切，图3、图4可见在500bp处有一条亮带，与预期的结果相符。 2.4 优化前后的序列测定和比较 将两种重组质粒送上海生工测序，测定所得的序列，用软件vector NTI将序列测定结果与GENEBANK中人IL-18序列（E17135）比较，可见野生型IL18成熟肽基因片段的序列与GENEBANK中IL18序列对比完全相同，与野生型IL-18相比，优化后的密码子改变达71aa，其中包括37aa稀有密码子，其余为在大肠杆菌中利用率相对较低的密码子。但氨基酸序列无任何改变。2.5 5端，3端RNA结构和自由能优化结果 考虑到5端，3端RNA结构和自由能对产物表达的影响，对表达载体与外源基因相接处的5端- 3039区域，以及3端3039区域的RNA二级结构和自由能进行优化，改造前后的结果如图5。可见改造后RNA5端的自由能降低，稳定性增高，起始密码子ATG暴露，有利于蛋白的表达；3端复杂性增高，自由能降低，稳定性增高，不易降解。 2.6 热诱导表达产物的SDSPAGE电泳鉴定 优化的重组工程菌与未优化的重组工程菌在相同条件热诱导表达，提取包涵体，经8M尿素处理后经SDSPAGE电泳由图6可见相对分子量约20000处有一特异性条带，与预期的相符。优化后的目的蛋白产量明显高于未优化的产量，大约为后者的4倍。BCA法测定优化后的产物表达量为120mg/L，与国外报道接近4。 2.7 诱导表达的条件优化 经SDSPAGE可知，LB培养基内的amp浓度对表达量无影响，采用低接种量（1：100）可以明显提高目的蛋白的产量。因此表达条件最终定为：amp浓度为50g/ml，接种量为1：100（图7） 2.8 Western-blotting检测结果 将PBV220/mhIL-18表达的包涵体经复性和纯化后进行SDS-PAGE电泳，再转移到NC膜，然后经过免疫印染，图8可见20kD处出现相应的区带。 3 讨论 人IL18的全长cDNA编码193aa，分子量约为18.3Kda，包含一个36aa的特殊引导序列，缺乏传统的信号序列。其成熟肽为157aa，是在36Asp和37Tyr之间由IL1转化酶（ICE）酶切所致。IL18分子没有N糖基化位点及疏水信号肽，以单体形式发挥作用。虽然有4个Cys，但无二硫键形成。基于它的这些特性，可以采用原核表达生产重组IL18。由于本研究是为了生产基因工程细胞因子产品，因此没有选择融合表达载体，而是采用非融合表达载体pBV220进行表达。 由于IL18分子没有信号肽序列，前体需经ICE切割后才具有生物学活性。因此我们在设计PCR引物时去掉了人IL18的引导序列，只扩增其成熟肽序列，在编码其成熟肽序列第一个氨基酸密码子前加了起始蛋氨酸密码子，保证其在大肠杆菌中的原核表达。由于采用双酶切定向克隆，成功得到阳性重组子，经酶切和测序鉴定，与GENEBANK中序列完全一致。 遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子（optimal codons），那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子（rare or low-usage codons）。实际上用做蛋白表达或生产的每种生物（包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、Pichia、植物细胞和昆虫细胞）都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母、果蝇、灵长类等每种生物都有独特的8个密码子极少被利用。有趣的是，灵长类和酵母有6个同样的利用率低的密码子。大肠杆菌、酵母和果蝇中编码丰度高的蛋白质的基因明显避免低利用率的密码子。因此，重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响（尤其在异源表达系统中）的事实并不很奇怪。成簇的低利用率的密码子抑制了核糖体的运动，这是基因不能以合适水平表达的一个明显机制。核糖体翻译由九个密码子组成的信使（含几个低利用率密码子或全部为低利用率密码子）时的运动速度要比翻译不含低利用率密码子的同样长的信使的速度慢。即使低利用率密码子簇位于3端，信使最后也会被核糖体“拥挤”而损害，核糖体又回到5端。3端低利用率密码子簇的抑制效应可以和全部信使都由低利用率密码子组成的抑制效应一样大。如果低利用率密码子簇位于5端，其效应是起始核糖体数目的全面减少，导致蛋白合成中信使的低效率。散在分布的稀有密码子对翻译的效应还未很好地研究，但是有证据表明这种情况的确对翻译效率有负面效应。利用偏爱密码子（preferred codons）并避免利用率低的或稀有的密码子可以合成基因，基因的这种重新设计叫密码子优化。 在人IL-18中，有8个精氨酸残基由AGA和CGG编码，而其在大肠杆菌中的使用频率仅为0.21和0.465。这对蛋白在大肠杆菌中的表达影响很大，同时，其他类型的稀有密码子也对异源表达造成一定程度的影响。 为了解决由于稀有密码子造成的蛋白质表达量低的问题，目前常用以下几种方法：（1）共转化含有编码携带稀有密码子的tRNA基因的质粒；（2）在经基因工程改造，含有携带稀有密码子的tRNA的大肠杆菌中表达目的蛋白；（3）体外定点突变；（4）全基因人工合成适合表达的序列。在前两种方法中，只有有限种类的tRNA被转入，对整个表达量增加的影响受到限制。在第三种方法中，由于实验条件和方法的限制，不易对所有位点进行突变，对多个位点进行突变时，操作复杂。随着寡核苷酸合成技术的不断进步，现在我们可以采用全基因合成的方法，合成含有最优化的密码子的全基因，最大化地利用表达宿主的翻译效率。同时，这种方法不需采用特殊的大肠杆菌菌种，适用范围更加广泛。为了实现人IL-18在大肠杆菌中的高表达，我们人工合成了6条长度为95101aa，且其中两两之间有2224aa重叠氨基酸残基的寡核苷酸链，应用overlap PCR技术，扩增出与野生型IL18成熟肽基因密码子相差达71aa，但氨基酸序列不变的，各氨基酸密码子比例适合于大肠杆菌原核表达的突变型IL18序列。将其插入pBV220载体，转化大肠杆菌经诱导表达，目的蛋白的产量在相同条件下比野生型序列增加达3倍，证明用这种方法增加IL18蛋白表达是可行的。事实上，这种方法已被国外很多制药公司用于基因工程药物的生产上，经过优化的序列往往成为其核心技术，受到专利的保护。 PBV220是我国科学家自己构建的原核高效表达载体,该载体是一种温控型的、非融合表达载体，特点是集Clt857基因与PRPL启动子为一体，以便于转化多种菌株;具有较佳的SD序列，便于插入外源基因的多克隆位点及较强的转录终止信号。至构建以来，该载体已成功高效表达了人白介素2等20余种具有重要经济价值的多肽5。但是，采用PBV220载体表达人IL-18时，表达产量很低。李伍举等建立了PBV220载体中外源基因高效表达的判别模型。该模型认为，外源基因的表达水平与其5端 3039区域，以及3端30-39区域的RNA二级结构自由能具有显著的统计学意义;其次与3端9bp的局部密码子偏性相关6。运用此数学预测模型对其载体与目的基因相连处5端 3039区域，以及3端30-39区域的二级结构自由能进行分析时，发现其5端不够稳定，而且ATG处于发夹结构中，不利于转译的进行。因此，在用计算机辅助设计寡核苷酸链时，同时考虑密码子优化和RNA二级结构与自由能的因素，使改构的人IL-18基因与PBV220载体连接处的RNA二级结构及自由能水平达到预测模型所规定的阈值，ATG暴露7。本研究验证了该预测模型的可行性，从而实现了人IL-18基因在大肠杆菌中的高效表达。 随后我们又对诱导条件进行了优化，发现LB培养基内的amp浓度对表达量无影响，表明此重组质粒十分稳定，不易丢失。同时发现采用低接种量（1：100）可以明显提高目的蛋白的产量。降低初始接种量，可以使多数细菌都处于对数增长期，在此情况下进行表达，细胞活性很好，表达量高。如果接种量太大，细菌很快繁殖达到平台期，活性不高，虽然细菌量大，但表达量不高。因此最终采用的表达条件为：amp浓度为50g/ml，接种量为1：100。 对诱导条件的优化，消除稀有密码子、去除任何去稳定序列和利用最佳密码子的基因的重新设计都可能增加蛋白产量，使得蛋