重症急性胰腺炎大鼠HMGB1表达与肠黏膜屏障损害的关系.doc

重症急性胰腺炎大鼠HMGB1表达与肠黏膜屏障损害的关系 作者：栾正刚张成葛春林马晓春郭仁宣【摘要】 目的：观察大鼠重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）时肠组织中高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein , HMGB1）表达的变化及其与肠黏膜屏障损害的关系。方法：48只Wistar大鼠随机分为正常对照组（n=8）和SAP组（n=40）。正常对照组麻醉后取材，SAP组分别于建模后3、6、12、24和48 h取材。测定血浆D-乳酸、肠组织髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）水平，应用RT-PCR方法检测SAP大鼠肠组织中高迁移率族蛋白B1 mRNA表达的变化，应用western blot法检测SAP大鼠肠组织中HMGB1水平的变化。结果：随着SAP病情进展，血浆D-乳酸与肠组织MPO水平在24 h达最高值，分别为 （16.414.65） g/mL和（26.763.63） U/g（P <0.01）。SAP 6 h时大鼠肠组织HMGB1 mRNA及HMGB1表达水平显著高于对照组，并于24 h达峰值且持续至48 h（P <0.01）。结论：SAP大鼠肠组织中HMGB1表达延迟且持续增高。HMGB1作为晚期炎症介质参与了SAP大鼠肠黏膜屏障损伤的病理生理过程。 【关键词】 重症急性胰腺炎肠屏障高迁移率族蛋白B1 Relationship between high mobility group box-1 protein expression and gut mucosal barrier dysfunction during severe acute pancreatitis 【ABSTRACT】 Objective: To investigate the relationship between high mobility group box-1 protein （HMGB1） expression and gut mucosal barrier dysfunction during murine severe acute pancreatitis （SAP）. Methods: Forty-eight male health adult Wistar rats were divided randomly into Control group and SAP groups. The concentration of plasma D-lactate and the activity of myeloperoxidase （MPO） in the intestinal tissue were determined. The expression of HMGB1 mRNA in intestinal mucosa was detected by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） and the activity of HMGB1 was determined by Western blot. Results: Plasma D-lactate and MPO reached a peak level at 24h （16.414.65）g/mL for Plasma D-lactate and（26.763.63）U/g for MPO respectively, （P<0.01）. Elevation of HMGB1 and HMGB1 mRNA expression in intestinal mucosa was found at 6 hour after SAP, HMGB1 and HMGB1 mRNA expression peaked at 24 hours and kept relative high values up to 48 hour compared with normal control group （P<0.01）. Conclusion: The rise of HMGB1 expression might play an important role in the intestinal mucosal barrier injuries in SAP. HMGB1 as a late mediator was involved in the pathogenesis of SAP. 【KEY WORDS】 Severe acute pancreatitisIntestinal mucosal barrierHigh mobility group box-1 protein 重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）发病凶险、并发症多、病死率高，是临床上常见的危急重症。SAP时继发肠道屏障功能衰竭，肠腔内细菌及毒素可移位至胰腺和其他脏器， 其中胰腺和胰周感染是SAP的主要死因1-2。有研究表明，高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）作为一种重要的晚期炎症介质，在炎症反应过程中表达升高较晚，维持时间较长，参与了感染性休克及多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）的发生、发展过程。本研究通过观察大鼠SAP模型肠组织内HMGB1的变化，研究其与肠黏膜屏障损害的关系，旨在从新的角度探讨SAP肠黏膜屏障损害的发生机制。 1材料与方法 1.1动物分组与SAP模型制备健康雄性Wistar大鼠48只，体重270330 g，由中国医科大学实验动物学部提供。随机分成6组，取其中1组为正常对照组，另外5组分别为SAP建模后3、6、12、24和48 h组。大鼠术前12 h禁食不禁饮。2戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉（1 mL/kg），常规消毒后，腹部正中切口入腹腔，找到胆胰管，于其出肝门端以动脉夹暂时夹闭胆管，以5号针头注射器逆行刺入胆胰管内，于胆胰管入十二指肠端用小动脉夹暂时夹闭胆胰管，以0.1 mL/min速度匀速注入5牛磺胆酸钠（1.5 mL/kg，Sigma公司产品），注射完毕后10 min去除动脉夹，逐层关腹。术后禁食，自由饮水，皮下注射生理盐水40 mL/（kg6 h），行液体复苏。正常对照组麻醉后取距回肠末端10 cm左右小肠组织，SAP组分别于建模后3、6、12、24和48 h取材,部位同对照组。腹主动脉采血，离心（3 000 r/min 15 min）分离血浆，-80 冻存待测。无菌采取组织，液氮速冻，-70 贮存备用。 1.2观察指标 1.2.1小肠髓过氧化物酶活性测定取待测组织100 mg加0.5% HTAB 2 mL制备匀浆，超声粉碎（10 s，3次）亚细胞成分，04 40 000 r/min离心15 min，取上清0.1 mL加反应液2.9 mL，保持温度25 ，立即于分光光度计460 nm波长下进行扫描，时长120 s。以第30 s到第90 s的吸光度的变化代表酶活力的改变。1单位小肠髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）活力以25 时分解1mol H2O2来表示。所有操作均在水浴中进行。 1.2.2血浆D-乳酸水平测定将血浆标本0.6 mL + 50 L高氯酸，漩涡混匀，3 000 r/min离心10 min，留取上清液0. 5 mL,加30 L 5. 8mol/L KOH，混匀， 3 000 r /min离心10 min，除去高氯酸钾沉淀 ，留取上清液0. 4 mL，分成2管（空白管和样品测定管），各0. 2 mL。每管加pH 9. 5 甘氨酸硫肼溶液（含2 mg/mL的 NAD+ ） 0. 9 mL；样品测定管加50 L D-LDH，空白管加50 L水，置37 水浴90 min；空白管调零后，在340 nm处测定样品测定管吸光度值4。根据标准管吸光度值（标准品购于Sigma公司） ，计算各样品D-乳酸浓度。 1.2.3肠组织HMGB1水平检测采用western blot法检测。取200 mg肠组织研磨粉碎后，加入1 000 L新鲜配置的冷蛋白裂解液（50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5、150 mmol/L NaCl,2 mmol/L EDTA,1% SDS），经4 ，12 000 r/min离心20 min，取上清液，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取40 g蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5 min，SDS-PAGE电泳分离样品后电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭过夜，加入1:400 羊抗 HMGB1抗体（Santa Cruz）4 孵育过夜后，加入二抗37 孵育1 h，显色。采用凝胶成像分析系统（GDS-8000）测定各条带的吸光度值，以此代表蛋白的表达量。 1.2.4肠组织HMGB1 mRNA的表达取小肠组织80 mg，以异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA （TaKaRa公司试剂盒）。用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术对转录产物进行扩增,以三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehydes 3 phosphate dehydrogehase, GAPDH）作为内参对照,以目的基因与内参对照的比值为基因表达的相对含量。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后照相。大鼠HMGB1序列5（扩增片段为680 bp）: 5-ATGGGCAAAGGAGATCCTA-3（正义链）; 5-ATTCATCATCATCATCTTCT-3（反义链）。大鼠GAPDH序列6（扩增片段为309 bp）:5-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3（正义链）;5-AGATCCACAACGGATACATT-3（反义链）。 1.3统计学处理数据均以xs表示，SPSS 10.0统计分析软件进行处理，采用单因素方差分析和q检验， P0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1血浆D-乳酸水平变化SAP 3 h时血浆D-乳酸水平较正常对照组上升不明显；在SAP建模后6 h时血浆D-乳酸水平（9.723.26） g/mL，与正常对照组（3.941.51） g/mL比较，明显上升，P<0.01；SAP 24 h时达最高值（16.414.65） g/mL，48 h时仍显著高于对照组（表1）。 2.2肠组织MPO活性变化正常对照组大鼠肠组织MPO活性较低，SAP 6和12 h时其活性均显著高于正常对照组（P<0.01）。SAP大鼠肠组织MPO活性于24 h时达最高值，并持续至48 h（见表1）。 2.3肠组织HMGB1水平的变化正常情况下大鼠肠组织中有少量的HMGB1表达。与正常对照组相比，SAP组肠组织中可见HMGB1表达增高。SAP 6 h肠组织中HMGB1表达明显增高，12 h呈现进一步升高趋势，2448 h维持在较高水平（见表1、图1）。 2.4大鼠肠组织HMGB1 mRNA表达变化正常情况下大鼠肠组织有较低的HMGB1 mRNA表达，与正常对照组比较，SAP 6 h和12 h肠组织中HMGB1 mRNA表达增高，SAP 24 h时肠组织HMGB1 mRNA表达明显增高并持续至48 h（见表1、图2）。 3讨论 SAP时肠黏膜屏障功能受到损害，导致细菌和内毒素的移位，从而引发肠源性感染和内毒素血症，严重时可促使多器官功能衰竭发生。Ammori等发现SAP患者肠黏膜通透性明显增加。SAP时肠黏膜屏障受到损害，主要通过肠系膜淋巴结胸导管体循环途径发生细菌及内毒素移位，细菌移位至胰腺可导致胰腺坏死组织继发感染，进入血循环可进一步刺激活化单核巨噬细胞，释放更多的细胞因子和炎性介质，从而发生全身炎性反应综合征，进一步诱发MODS，最终导致死亡。HMGB1较TNF-、IL-1等早期炎症介质分泌延迟且持续时间较长,故被称作“晚期”炎症介质，。HMGB1为细胞核内非组蛋白,在创伤应激或严重感染、脓毒症等病理情况下可大量表达并分泌至胞外,参与了脏器损伤过程-。 本研究结果显示，SAP建模后612 h，大鼠肠组织中HMGB1表达才明显增高，于SAP建模后24 h，大鼠肠组织中HMGB1水平达峰值并持续至48 h。有资料表明HMGB1呈时间-剂量依赖性增加肠上皮通透性，而这必将加剧肠源性细菌与内毒素移位。在SAP大鼠肠组织HMGB1延迟并持续增高的同时，反映肠组织炎症细胞浸润程度的MPO活性亦显著的升高，说明SAP大鼠肠组织中有大量中性粒细胞浸润和过量的活性氧自由基生成。当肠道屏障通透性增加，肠道中细菌产生的D-乳酸可吸收入血，因而血中D-乳酸水平升高可反映肠黏膜损伤程度和通透性的改变。本研究结果显示，随着HMGB1表达的升高，SAP大鼠血浆D-乳酸水平持续升高，提示肠黏膜通透性持续增加。因此，我们推测SAP时，大鼠肠组织HMGB1表达上调在肠黏膜损伤中具有重要意义。SAP时TNF-、IL-1等早期炎症介质迅速合成释放，但是难以做到早期预防性治疗。本研究结果显示, SAP时HMGB1作为晚期炎症介质介导了肠黏膜屏障功能不全的发生与发展。【参考文献】 1 Garside P, Millington O, Smith KM. 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