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荧光诊断技术在头颈肿瘤早期诊断中的应用【摘要】 自身荧光诊断与光动力学诊断是新型的肿瘤早期诊断方法，在各种肿瘤尤其是头颈肿瘤的诊断和研究中，具有广阔的发展前景及临床意义。现就其技术原理、组成、在肿瘤早期诊断中的运用及发展前景作一综述。 【关键词】 光动力学诊断 自身荧光 头颈肿瘤 早期诊断 肿瘤严重威胁人类健康，早期诊断对提高患者的生存率和生活质量有非常重要的意义。荧光诊断技术是浅表肿瘤早期诊断的一种方法，操作简单,灵敏度高，对确定手术切缘和发现重复癌有肯定的作用1。目前荧光诊断方法主要有两种：自身荧光诊断法(autofluorescence，AF)，药物荧光诊断法即光动力学诊断 (photodynamic diagnosis，PDD) 。 1 AF/PDD系统的原理 AF是在一定波长的激光激发下,处于激发态的分子在下降到基态的过程中,以光量子的形式释放出它所吸收的能量即荧光。人体组织的蛋白质、核酸和类脂化合物含有荧光团，如FMN、NADH、NADPH、弹性蛋白、角蛋白等，光谱中的蓝色光可激发荧光物质发光。与相应的正常组织相比,异常组织的物理、化学特性均发生变化，因而对应的自体荧光光谱存在特异性差异，从而将肿瘤组织和正常组织区别开来25。 PDD是先向患者静脉注射、吸入或局部灌注光敏剂，利用肿瘤组织对光敏剂的亲和性，使原卟啉(protoporphyrin IX，PpIX)在肿瘤组织中选择性聚积68，一段时间后在病变组织和正常组织间形成显著的浓度差，在特定波长的激光照射下，病变组织发射出较强且具有特定波长的荧光，而正常组织无此吸收峰或吸收峰很弱，而将肿瘤和正常组织区分开来。 1924年，Policard9首先认识到肿瘤组织中存在的内生性卟啉在紫外和蓝光照射下产生荧光。1954年，Ronchese10在人类皮肤鳞癌的溃疡面上观察到了内源性红色荧光的存在。20HJ1.9mm世纪60年代早期，Ghadially等11发现了局限于肿瘤溃烂表面的亮红色荧光，证实是由于微生物合成卟啉的结果，并且可以从肿瘤表面擦去，认为在5ALA存在的情况下，坏死组织中的许多微生物能够合成卟啉，产生红色荧光。1984年，Alfano等12首次用自身荧光系统将肿瘤组织与正常组织区别开来，随着研究的深入，自身荧光逐渐应用到临床。 1942年，Auler等13观察发现选择性定位到细胞内的荧光标记物，并报道了卟啉对肿瘤组织的亲和性和PDD用于提高恶性肿瘤诊断率的可能性。Leonard等14验证了静脉内应用血卟啉混合物可诊断口腔、下咽和喉肿瘤，发现这种方法可以诊断黏膜癌，他们在29例黏膜癌中都观察到特征性的红色荧光；主要缺点是不能准确判定肿瘤的边界和用光敏剂后出现皮肤过敏。1972年，Dunn等15对54例上消化道肿瘤患者进行四环素诱导荧光的有效性研究，表明四环素诱导的荧光能在肿瘤组织中有效聚集。1990年，Kennedy等16首次提出用5ALA诱导PpIX荧光成像来诊断口腔黏膜的癌前病变和癌，认为可能是具有肿瘤定位特性的荧光标记物5ALA增加了血红素合成酶的活性，导致PpIX在肿瘤组织的选择性聚集。 1.1 光敏剂 光敏剂是进行PDD的基础，理想的光敏剂在肿瘤组织中特异性地聚积,而在正常组织中不蓄积或少蓄积。光敏剂可分三代:第一代为血卟啉类混合物(HpD), 是由8种成分组成的混合物，主要成分为双血卟啉醚或酯，约占药物总量的20% 30%，批准上市的有光福啉(photofrin)和癌光啉(PSD)等。第一代光敏剂成分复杂，组织选择性差，光动力学效应不稳定，容易引起皮肤光过敏反应，避光时间长，一般需1个月。第二代光敏剂为卟啉类衍生物或合成物，如二氢卟吩e6(chlorin e6)、间四羟基二氢卟酚（mTHPC）、血卟啉甲醚和5氨基乙酰乙酸(5ALA)等。与第一代相比其特点是成分均一，毒性小；在体内代谢快，一般24?h代谢完毕；避光时间短，只需1?d左右，不易引起皮肤光敏反应；组织选择性较强，容易在肿瘤组织中聚集。第三代是一些修饰产物，如生物结合物（抗体结合物、脂质体结合物等）和内含光淬灭或光漂白特性的结合物，对肿瘤组织有更高的选择性和特异性，处于实验研究阶段。 理想的光敏剂应该满足以下几个条件7：（1）成分单一；（2）在可见光的远红外区有较大吸收峰；（3）能产生高的三重态的量子场；（4）有很好的细胞毒素氧化酶生成能力；（5）对肿瘤组织有较强的选择性；（6）没有暗毒，所谓暗毒即在缺乏光线的情况下仍具有细胞毒性，对机体造成损害17,18。 1.2 光源和设备 AF激发光源系统为DLIGHTAF(Storz,德国),PDD光源系统为DLIGH(Storz,德国)，二者均可用300?W短弧氙灯为光源，通过滤光片（=375 440?nm）过滤后以蓝光源为激发光，摄像系统是高清晰度彩色三镜片数码系统（3CCD，Storz德国），内镜或荧光内镜，有的还需要显微镜设备。可通过一个脚踏开关来控制荧光和白光的切换。另外还需激光导光纤维等。 目前应用的内镜荧光图像系统主要是DLight和LIFE系列。DLight系统（Storz, 德国）的激发波长范围为375 440?nm，通过特殊的滤波和处理可以获得高彩色对比度的荧光图像。在该系统中，荧光系统与常规白光系统可以转换。LIFE系统（Xillix Corp,加拿大）以437?nm的蓝光作为激发光源,荧光通过490 569?nm的绿色荧光和630?nm以上的红色荧光这两个隔离的通道检测，经处理后显示图像，在LIFE系统中，荧光检测与常规内镜可以通过光源自由切换。 2 检查方法及结果分析 进行PDD之前,先对患者行光敏剂皮试，阴性后方可进行，光敏剂溶液原则上现配现用，用不完的需避光保存。应用方法有：（1）静脉给药，多用于头颈、肺、肝、肾等部位肿瘤的诊断，一般人的剂量10 36?mg/kg，动物模型剂量为100 400?mg/kg，在给药3?h后检查；（2）口服给药,多用于乳腺癌、肝癌及脑部肿瘤的诊断，用量为30 40?mg/kg，在用药2 4?h后检查；（3）雾化吸入，多用于咽喉、支气管、肺等部位肿瘤的诊断，一般为1%的5ALA溶液，用药30?min后检查；（4）局部灌注，常用于膀胱肿瘤的检查，一般为1% 3%的ALA溶液，多在用药2?h后行荧光内镜检查。AF系统可直接用荧光镜检查可疑部位。 结果分析主要分为荧光光谱技术和荧光图像技术两种，目前自身荧光诊断法以光谱分析为主，光动力学诊断法采用图像和非图像处理方式。两种方法同时使用，可准确地对病变定位，并根据检查结果立即进行活检或治疗, 操作十分方便。 3 AF/PDD系统在肿瘤早期诊断中的应用 3.1 基底细胞癌 基底细胞癌是常见的皮肤恶性肿瘤，多发于头颈部，靠活检病理诊断。Ericson等192003年用5ALA诱导荧光诊断基底细胞癌，研究肿瘤组织和肿瘤周围正常组织的荧光强度比值与光敏剂应用时间的关系。40例患者被随机分为4个不同光敏剂应用时间组（1，2，3，4?h），将20%的光敏剂5ALA乳剂涂抹在肿瘤部位，厚约1?mm，光源为装有滤光片水银灯，提供波长365 405?nm的激发光，照射时间4?s，总的照射强度0.5?mw/cm2。3?h后，肿瘤组织和正常组织的荧光强度比值最大，此时行PDD最合适。Fritsch等20在光动力学诊断的引导下成功切除了1例复发的多发性基底细胞癌，并获得良好的美容效果。术后随访9个月无复发。 3.2 口腔癌 Chang等212005年局部应用光敏剂光福啉（photofrin），通过光动力学诊断口腔肿瘤。有20名患者（男19例，女1例， 30 82岁，平均53.7岁），用浓度为2.5?mg/ml Photofrin嗽口，3?h后进行荧光和白光内镜检查，每个患者在荧光内镜的指引下从4个不同的部位取活检，立即行组织病理学检查。结果表明，正常黏膜的荧光最弱，鳞癌的荧光最强，且正常黏膜与角化、鳞状化生及鳞癌的荧光强度差别有统计学意义（P<0.000?1）；角化与鳞状化生的荧光强度没有统计学意义（P=0.027）,联合应用红、绿、蓝、灰4种成像模式，肉眼观察的灵敏度为92.45%，特异度为95.65%，显微观察的灵敏度为93.75%，特异度为97.50%，认为光动力学是一种敏感、非侵袭、早期诊断口腔肿瘤的方法。 3.3 鼻咽癌 Ramaswamy等72005年将人类鼻咽癌细胞系CEN2移植到6 8周龄的balb/c雄性裸鼠，在实验前注入光敏剂，通过肿瘤细胞对光敏剂的聚积，能准确区分肿瘤边界。研究表明，光敏剂Fotolon(chlorin e6)能选择性地停留在鼻咽癌中，它的荧光峰在注入光敏剂Fotolon 1?h后便在肿瘤组织中出现，在3?h和6?h时，Fotolon在肿瘤组织的浓度分别是正常组织的8倍和28倍。有别于其他光敏剂之处是Fotolon能快速从体内清除，在24?h内有90% 98%的药物从肿瘤和正常组织中清除，建议在用药3?h后诊断。Qu等22用自身荧光诊断鼻咽癌，灵敏度和特异度分别为93%和92%，说明荧光内镜成像是诊断鼻咽癌的有效方法。 3.4 咽喉肿瘤 Csandy等62004年局部应用5ALA后，用以短亚弧灯为光源的内镜照射检查部位，被照射组织出现红色荧光为阳性，绿色荧光为阴性。共检查31例患者，包括13例喉癌，12例咽癌，4例黏膜白斑，2例声带息肉，除1例慢性喉炎外，所有显示红色荧光的，经病理学检查均证实为鳞癌。声带息肉显示绿色荧光。5ALA诱导PpIX荧光成像方法对肿瘤的灵敏度为96%，特异度为76%。13例喉癌在荧光内镜下用CO2激光切除，并用荧光内镜评估肿瘤切除边界，术后只有1例复发，为T2期声门癌。对4例癌前病变（喉白斑）的评估有争议，因为病理证实为慢性喉炎者也表现出了低强度（+）ALA荧光，过度角化、癌前病变（如白班）表现出没有或低强度荧光（0或0/+）。到目前为止，局部应用1% 5ALA溶液没有发现副作用。荧光内镜技术用于咽、喉表浅肿瘤的早期诊断非常重要，它能发现黏膜病变并在早期阶段（T1、T2）行内镜激光治疗或放疗。这种方法的局限性是仅仅评估肿瘤较表浅的外侵范围，因为ALA的渗透深度在1?mm以内。 3.5 喉癌 Arens等42004年等研究间接自身荧光喉内镜对喉癌及其先兆损害的诊断。以组织病理学诊断为标准，白光诊断准确率为78%（n=90）,间接自身荧光为89%（n=103）。间接自身荧光喉内镜的灵敏度为90%，特异度为87%。表明间接自身荧光喉内镜是一种快速、可重复、无创伤和经济的成像技术，有利于发现和描绘癌前病变、原位癌和喉癌，和单独应用白光检查相比更准确。李勇等23用自身荧光内镜诊断早期喉癌及癌前病变，也得出了相似的结论，但由于炎症、水肿和瘢痕的存在，降低了自身荧光内镜诊断的特异度。 Palasz等242003年通过自身荧光成像技术研究喉的正常和癌变组织。证实了自身荧光内镜相对于单用白光内镜，在早期喉癌的诊断上有高度的灵敏度和高度的特异度，分别为86.9%和82.8%。Zargi等2对喉恶性肿瘤、Betz等25对头颈肿瘤的研究都获得了相似结果。自身荧光成像在喉内镜中是一种非常有用的辅助诊断工具。 3.6 食管肿瘤 Mayinger等262001年用荧光内镜和白光内镜对比研究22例食管癌患者（男20，女2；13例T0N0M0，8例T1N0M0，1例T3N1M0），并以组织病理学诊断作为参照标准。患者口服5ALA溶液，用量15?mg/kg，服药6 7h后进行PDD检查。每个患者都进行白光内镜、荧光内镜和组织病理学检查，共取活检组织86块。结果PDD的灵敏度为85%（17/20），特异度为53%，白光内镜的灵敏度为25%（5/20），特异度为94%，表明PDD有较高的灵敏度。食管炎症和新生上皮在蓝光激发下，也表现出红色荧光，增加了PDD的假阳性率，降低了特异度。缺点是没有采用盲法设计，样本例数较少。伊力亚尔复合丁等27用雄性日本白兔制作食管癌动物模型，静脉应用光敏剂二氢卟酚e6（Npe6）,用半导体激光照射，研究光动力学诊断较深部食管肿瘤的可行性。结果表明二氢卟酚e6用量为5.0?mg/kg，给药6?h后行光动力学诊断是可行的，能将肿瘤与周围正常组织区别开来。 除头颈肿瘤外，荧光诊断技术还用于其他领域。Lipinski等28应用检测膀胱肿瘤抗原与光动力学诊断两种方法，对比研究经病理学证实为复发的膀胱浅表肿瘤。膀胱灌注3%的5ALA溶液，2?h后行PDD检查，81%的患者（35/43）试验结果阳性。由于PDD能更早发现新生物，使膀胱癌的复发率减少50%29，30，已广泛用于临床。Ludicke等31用PDD方法进行卵巢癌动物模型微转移的实验研究，并比较PDD和标准白光内镜发现腹腔微转移数量的多少。结果表明，PDD显著高于白光内镜发现的转移数量(P<0.01)，ALA诱导荧光成像发现癌变数是普通白光的2倍，更有利于发现腹腔微转移病变。Banerjee等32、Sheski等33回顾了近20年关于支气管肺癌PDD诊断和治疗的文献，认为PDD能明显提高不典型增生和原位癌的发现率，缺点是假阳性率较高，需进一步研究。Ladner等1研究乳腺肿瘤的光动力学特点，认为荧光诊断技术是用于术中诊断和指导肿瘤切除边界的一种简便方法。 4 展 望 作为一种新兴的肿瘤诊断方法，荧光诊断敏感性高,特异性强， 操作简单，是无创性诊断早期癌及其癌前病变的辅助性方法，尤其对于肉眼难以发现的微小癌变和不典型增生的早期诊断具有重大意义。但是PDD仍然存在皮肤对光敏剂的过敏问题，随着新一代光敏剂的研制及用药方式的改变，光敏性皮炎等副作用的发生率已大大减少；其次是特异性不高，导致患者接受不必要的组织活检或手术，增加了痛苦。AF荧光强度低，易受干扰，对肿瘤边界分辨率较低，但无明显副作用。将二者结合起来，根据不同的部位采用不同的方法，可提高诊断的准确性，减少副作用。【参考文献】 1 ZK(#Ladner DP, Steiner RA, Allemann J,et al. 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