《提取分离鉴定》PPT课件.ppt

第二章 中药化学成分的提取、分离和结构鉴定,本章内容包括：,一、提取方法 二、分离纯化方法 三、结构鉴定方法,升华法 水蒸汽蒸馏法 溶剂法 超临界萃取法 其他提取方法,第一节 提取(extract),1、升华法(sublimation),某些物质(如樟脑)受热在低于其熔点的温度下，不经熔化就可直接转化为蒸气，蒸汽遇冷后又凝结为固体称为升华。 中药中有些成分具有升华性质，能利用升华的方法直接从中药中提取出来。如从樟木中升华樟脑在本草纲目中已有详细记载，茶叶中咖啡因的提取（178）。,2、水蒸汽蒸馏,适用范围：用于能随水蒸气蒸馏、不被破坏的难溶于水的成分。 该类成分有挥发性，在100时有一定蒸气压，当水沸腾时，该类成分一并随水蒸汽带出，再用油水分离器或有机溶剂萃取法，将这类成分自蒸馏液中分离。 装置：挥发油测定器,挥 发 油 测 定 器, 3、溶剂提取法,（1）溶剂 (solvent) 常用溶剂分类及极性由弱到强如下： Petroleum ether(PE)CCl4BenCHCl3Et2O EtOAcn-BuOHMe2COEtOHMeOHH2O （2）选择溶剂的要点: 相似相溶 沸点适中易回收 价廉低毒安全,（3）溶剂的选择 相似相溶（ like dissolves like ）,石油醚或汽油提出油脂、蜡、叶绿素、挥发油、游离甾体三萜类化合物。 氯仿或乙酸乙酯提出游离生物碱、有机酸及黄酮、蒽醌、香豆素苷元等中极性化合物。 丙酮或乙醇甲醇提出苷类、生物碱盐、鞣质等极性化合物。 水提出氨基酸、糖类、无机盐等水溶性成分。,常用溶剂的特点：,H2O：溶解范围广，（生物碱盐、苷、鞣质、蛋白质、糖）对组织穿透力强，价廉易得，无污染。苷类易酶解，药液易发霉变质，含淀粉，果胶、粘液质多的中药材水提液粘稠，难过滤，含水杂多。 EtOH：溶解范围广，水杂（蛋白质、糖、粘液质）少，不同浓度溶解力不同，可回收，相对价廉。 CHCl3：选择性强，不溶解水溶性成分，防霉，不燃烧但有毒，不宜大规模使用。,（4）影响提取的因素,药材的粉碎度：适当粉碎（粗粉），以增加与溶剂接触的面积。 温度：温度高有利于提取。 浓度差：越大越好，可搅拌、换溶剂、渗漉来增加浓度差。 时间：需要时间，但并非越长越好。 药材新鲜程度：有机溶剂提取时宜用干燥药材，水提时，含大量油脂的药材应先脱脂。,a、煎煮法 b、浸渍法 c、渗漉法 d、回流法 e、连续回流法（索氏提取Soxhlets extraction）,（4）提取操作方法,煎煮法加水加热提取法,特点：简便，大部分成分可不同程度地提出，含挥发性成分、含大量淀粉及加热易破坏的成分不宜，药液粘稠难过滤。 适用范围：含淀粉较少，成分遇热不易破坏的药材。,粉碎好的药材放入提取用的容器中，加入溶剂使没过药面，浸泡12小时。,加入溶剂浸泡,12小时后,浸渍法,滤出溶剂，加入新的溶剂继续提取,渗漉法,向中药粗粉中不断添加浸出溶剂使其渗过药粉从渗漉筒下端出口流出浸出液的一种浸出方法。 特点：在渗漉过程中随时保持相当浓度差，故提取效率高于浸渍法。溶剂消耗大，费时麻烦。,渗漉法,回流法有机溶剂加热回流提取法 特点：效率高可选用不同有机溶剂提取，溶剂消耗量较大。 适用范围：受热易破坏的成分不适用。 连续回流提取法为回流法的发展 特点：所用溶剂量少，操作简单，效率高。 适用范围：受热易分解成分不宜采用此法,回流法,连续回流法 (索氏提取) (Soxhlets xtractor),a、常压蒸馏 b、减压蒸馏 c、旋转蒸发 d、薄膜蒸发,（5）过滤的方法,（6）回收溶剂方法,a、常压过滤 b、减压抽滤 c、离心,蒸馏装置,旋转蒸发仪,薄膜蒸发,4、超临界萃取法,超临界流体-处于临界温度和临界压力以上，介于气体和液体之间的流体。 超临界流体萃取中最常用的物质:CO2，它的临界温度（Tc= 31.4）接近室温，临界压力(Pc=7.37Mpa) 优点： 可以在接近室温下进行工作，防止某些对热不稳定的成分被破坏或逸散。 萃取过程几乎不用有机溶剂，萃取物中无有机溶剂残留，对环境无公害。 提取效率高，集提取分离于一体,节约能耗。可用于工业化生产。 夹带剂:甲醇、乙醇、水等，增加极性改善溶解度。,5、其他提取方法,超声波提取法 微波提取法 半仿生提取法 压榨法,第二节 分离(isolation ,separation),分离：将提取物中所含的各种成分一一分开，并将得到的单体加以精制的过程。,第二节 分离(isolation ,separation),根据物质溶解度不同进行分离 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 根据物质吸附性差异进行分离 根据物质分子大小差别进行分离 根据物质离解度不同进行分离,利用温度不同引起溶解度的改变以分离物质的方法，是纯化固体物质最后阶段常用的方法。结晶和重结晶。,（一）结晶法（crystalling）,该法的关键是选择合适的结晶溶剂： 对溶解成分的溶解度随温度不同有显著差别（热时溶解度大，冷时小）而杂质溶解度变化小。 与成分不产生化学反应 沸点适中。当单一溶剂不能达到结晶时，可用混合溶剂。,结晶操作方法： 选用合适的溶剂将混合物加热溶解，趁热滤去不溶性杂质，滤液低温放置或蒸去部分溶剂后再低温放置，使有效成分大部分析出结晶。可重复操作多次。,结晶纯度的判断： 颜色、晶形一致； 熔点、熔距2； 层析，三种不同层析条件下均为单一斑点。,水/醇法： 药材水溶液 数倍高浓度乙醇 （糖类、蛋白质等沉淀） 醇/水法： 药材醇浓缩液 加数倍水 （树脂、叶绿素等脂杂） 醇/醚（丙酮）：加数倍乙醚（丙酮） 药材醇浓缩液 （皂苷、树脂等脂杂留 在母液中）,（二）沉淀法 1. 溶剂沉淀法,1. 溶剂沉淀法,基于某些天然药物成分能与某些试剂生成络合物降低溶解度而自溶液中析出得以分离。 如将所需成分沉淀，则此沉淀反应须是可逆的 ； 如将不需成分沉淀，则此沉淀反应可以是不可逆的 ；, 铅盐沉淀法,中性Pb(Ac)2 ：沉淀含有-COOH和邻二酚OH 碱性Pb(OH)Ac ： 沉淀上者+单元酚类+某些大分子中性成分,脱铅： 通入H2S 法 Pb2+ + H2S PbS (吸附成分有损失） 中性硫酸盐法 Pb2+ + SO42- PbSO4 (优，中性吸附少),2. 酸碱沉淀法,对难溶于水的酸性、碱性有机化合物，常通过加入酸、碱以调节溶液的pH， 改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。,酸溶碱沉法： 药材酸水液 加碱调至碱性 （脂溶性生物碱沉淀） 碱溶酸沉法： 药材碱水液 加酸调至酸性 （脂溶性酸性成分沉淀）,3. 专一试剂沉淀法,雷氏铵盐沉淀生物碱而与非生物碱类分离 胆甾醇沉淀甾体皂苷而与三萜皂苷类分离 明胶沉淀鞣质而与其它水溶性成分分离,返回23,4. 盐析法,在中草药的水提液中加入无机盐（NaCl,Na2SO4,MgSO4）至一定浓度或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。,三七的水提液 MgSO4 至饱和 （三七皂苷乙）,（三）简单萃取法（simple extraction）,原理：利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。 分配系数相差越大，分离效率越高。,选择萃取剂的原则：相似相溶 在水中分离亲脂性成分，多用亲脂性溶剂。 如：苯、乙醚、氯仿（比重大于水） 在水中分离亲水性成分，多用弱亲脂性溶剂 如：乙酸乙酯、正丁醇,分配系数K,当溶质溶于两种相互不能任意混溶的溶剂（氯仿和水），则在一定温度和压力下，K为一常数。,K= CU /CL CU：溶质在上层溶剂中的浓度 CL：溶质在下层溶剂中的浓度,分液漏斗,分离难易与分离因子,用分离因子来表示分离难易： = KA / KB ( 在同一溶剂系统中，KA KB ) 100，仅作一次简单萃取即可实现基本分离； 10010， 须作萃取1012次； 2， 须作萃取100次以上； 1， KA= KB，无法分离，需要改变溶剂系统。,分配比与pH值,当溶液的 pH 3 时, 大部分酸性物质以游离型存在于有机相； 大部分碱性物质将以解离型(BH+)存在于水相。 当溶液 9pH12 时, 酚类以游离型存在有机相，羧酸存在水相。 当溶液的pH 12时， 大部分酸性物质以解离型存在于水溶剂中； 大部分碱性物质将以游离型(B)存在于有机相。,pH梯度萃取法,总提取物/乙酸乙酯 酸性 水萃取 酸水层 有机层 调pH12，有机溶剂萃取 NaHCO3 有机层 水层 NaHCO3层 有机层 （碱性物质）（糖等强极性、 酸化，有机溶剂萃取 NaOH液提萃取 中性物质） pH由高到低 有机层 NaOH层 有机层 缓冲液萃取 （有机酸等） 酸化，有溶剂萃取（中性物质） 分别得到碱性由强 到弱的碱性物质 有机层 （酚类物质）,（四）膜分离法(membrane separation technique MST),原理：以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在某种推动力（压力差，浓度差，电位差等）时，原料侧组分选择性的透过膜，已达到分离、提纯的目的。 特点： 分离时无相变，适合热敏成分的分离、浓缩。 不消耗有机溶剂（乙醇），生产周期短，有效成分损失少，环保。 选择性高。 适用范围广（热原，细菌有机物，无机物）。 可实现连续化和自动化操作，易与其他生产过程匹配，满足中药现代化生产要求。,膜分离技术的类型,膜分离技术在中药提取分离中的应用,用于提取中药有效成分 用于制备中药注射剂及大输液 用于制备中药口服液 用于制备药酒等其他中药制剂,（五）色谱分离法,按分离原理不同分为： 吸附色谱 （adsorbing chromatograph） 分配色谱 （ partition chromatograph） 离子交换、电泳、凝胶色谱等,按操作形式不同分为： 薄层色谱 （thin-layer chromatography; TLC） 柱 色 谱 （column chromatography） 纸 色 谱 （paper chromatography PC ）,吸附类型：,物理吸附（physical adsorption） 分子间力的作用，无选择性，吸附与解吸附可逆，常用。如硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂的吸附。 化学吸附(chemical adsorption) 化学键力的作用，有选择性，吸附解吸附不可逆，不常用。如酸（碱）性吸附剂对碱（酸）性物质的吸附。 半化学吸附(semi-chemical adsorption) 氢键力的作用，吸附力介于物理与化学吸附间，如聚酰胺对黄酮类、醌类、酚类等的氢键吸附。 吸附基本规律：极性相似者易于吸附,1、吸附色谱,吸附三要素：吸附剂，溶质，溶剂 吸附基本规律：相似者(极性)易于吸附 吸附剂分为： 极性吸附剂：硅胶、氧化铝 对极性物质吸附强，在弱极性溶剂中对物质吸附强 非极性吸附剂：活性炭 对非极性物质吸附强，在极性溶剂中对物质吸附强,【物理吸附】, 极性的判断,物质极性大小决定被物理吸附的强弱，如何判断极性大小呢？ 官能团的极性大小： -COOHAr-OHR-OHR-CHOR-CO-R R-CO-OR R-O-RR-XR-H 化合物的极性大小：分子量、官能团的种类、数目、位置决定。 例题：,分子内氢键,黄花夹竹桃果实中的强心苷成分,比较上述七种成分的极性大小？,（1） 硅胶、氧化铝液固吸附层析法（柱层、薄层）,原理：利用各组分被固定相吸附剂吸附强弱不同进行分离。 范围：适合于非极性到中等极性的脂溶性成分的分离。,吸附剂： 硅 胶略显酸性，通常用于酸性和中性成分的分离；105活化0.5h 氧化铝一般显碱性，按制备方法可分为酸、碱、中性三种，最佳活化温度200400。 洗脱剂或展开剂：极性（由小到大）有机溶剂 层析结果：极性小先被洗脱、Rf值大,TLC,基本操作： 1. 薄层板制备: (干法 , 湿法) 2. 点样 3. 展开,Rf=,1、原点 点样,2、展开 溶剂前沿,1,3. 定位 紫外灯下观察 喷雾显色,TLC基本操作,4. 计算Rf值 斑点1,TLC薄层层析法,展开,1、薄层板 2、展开剂 3、层析缸,（硫酸显色）,空白,三七,复方,TLC 定位、显色,紫外下观察荧光 空白 黄连 复方(三次) 标准品,TLC 定位,a,b,硅胶 TLC，展开剂：CHCl3-MeOH=95:5,化合物 a、b的极性？ 提示：硅胶为极性吸附剂,例：,例：比较下列化合物硅胶TLC，氯仿-甲醇（10：1）展开时， Rf的大小关系,A,B,C,D,硅胶、氧化铝柱色谱法 应用于化合物制备分离,柱层析分离模式,柱色谱,基本操作： 1.色谱柱制备 (干法 , 湿法) 2. 上 样 (干法 , 湿法) 3. 洗脱，合并相同洗脱液,柱色谱注意事项,玻璃柱规格：柱长度/直径15:120:1 吸附剂的用量：为分离样品量的3060倍； 难分离样品，可提高至200倍。 吸附剂的规格：一般为100目颗粒，不加压； 若使用200-300目，需加压。 洗脱剂： 根据TLC判断，混合溶剂梯度洗脱； 常用系统：石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇等； 初始洗脱溶剂比例，控制Rf 0.2-0.3条件。,（2）活性炭,是非极性吸附剂，对非极性物质具有较强的亲和能力，目前主要用来除去植物提取液中的叶绿素等植物色素。 此外，从大量稀水溶液中浓缩微量物质时，有时也可采用活性炭简单吸附法。如，用活性炭吸附法从一叶萩水浸液中提取一叶萩碱。,一叶萩碱,(3)半化学吸附- 聚酰胺液固吸附层析法（柱层、薄层）：,聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子物质，分子结构中有许多酰胺基。可与酚类、酸类、蒽醌类等成分形成氢键，因而产生吸附作用。 原理：各成分由于和聚酰胺形成氢键的能力不同，聚酰胺对其吸附能力也不同。,聚酰胺吸附色谱原理,吸附规律：, 溶剂对聚酰胺的洗脱能力为: 水乙醇丙酮稀氢氧化钠甲酰胺二甲基甲酰胺尿素 在含水溶剂系统中：（总体上是反相色谱） 与聚酰胺形成氢键的基团越多，吸附越强 形成氢键的基团： 酚羟基、羧基、醌式羰基 能形成分子内氢键的化合物，吸附较弱 邻位-OH吸附间、对位-OH 芳香核、共轭双键越多，吸附越强 例如：,应用范围：,对植物药中的黄酮类化合物的分离效果好，此外，在酚类、酸类、蒽醌类成分以及氨基酸的分离中也常用。 除去多元酚类杂质（如鞣质）可用聚酰胺。,返回,例：下列各化合物用聚酰胺柱层析分离，乙醇-水梯度洗脱，各成分洗脱次序,A,B,C,D,【凝胶过滤法】,原理：凝胶的固定相是一类多孔材料，孔径分布有一定的范围，象一面筛子，对不同大小的分子进行筛分。当混合物进入流动相后，就向固定相孔隙内扩散，组分保留程度取决于孔径的大小和组分分子的大小。大分子成分先流出。,（4） 凝胶色谱法,凝胶过滤法原理,凝胶颗粒,大分子物质,小分子物质,凝胶色谱原理,凝胶种类和性质：,Sephadex G ：葡聚糖凝胶，是由葡聚糖和甘油基通过醚桥相交联而成的多孔网状结构，亲水性，在水中溶胀。凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联剂的数量。Sephadex G只适合于在水中应用，主要用于分离水溶性高分子化合物如多糖、蛋白质； Sephadex LH-20：羟丙基葡聚糖凝胶, 既有亲脂性又有亲水性，它是在Sephadex G-25的羟基上引入羟丙基而成醚状态，与Sephadex G比较，它分子中羟基总数不变，但碳原子所占比例相对增加，因此可以在水中及极性有机溶剂中膨胀使用，扩大了使用范围。,交联葡聚糖凝胶化学结构,交联剂越多（交联度高），网孔越紧密，孔径越小，吸水膨胀也越小； 交联剂越少（交联度低），网孔越稀疏，孔径越大，吸水膨胀也越大； 商品型号即按交联度大小分类并以吸水量（每1g干凝胶吸水量ml*10）表示。 如：Sephadex G-50为1g干凝胶吸水量5ml，商品型号越大分离的混合物的分子量越大。 Sephadex G-50分离范围（分子量）多糖为50010000； Sephadex G-200分离范围（分子量）多糖为1000200000,（5）离子交换树脂法 用于分离酸性、碱性及两性混合物,（1）定义： 用一种能交换离子的材料（离子交换树脂）为固定相，以水或含水溶剂为流动相来分离离子型化合物的色谱方法。,（2）离子交换树脂结构：,外观为球形颗粒，不溶于水，但在水中膨胀，由以下两部分组成：, 母核部分：为苯乙烯通过二乙烯苯交联而成的大分子网状结构。网孔大小用交联度（即加入交联剂的%数量）表示。不同的交联度适于分离不同大小的分子。 离子交换基团,（3）分类：根据交换基的不同分类,阳离子离子交换树脂： 强酸性(-SO3-H+) 弱酸性(-COO-H+) 阴离子离子交换树脂： 强碱性(-N+(CH3)3Cl-) 弱碱性(-NH2,-NH-,-N-),（4）分离原理： 当流动相通过离子交换柱时，溶液中的中性分子及具有和交换基团相反电荷的离子将通过柱子从柱底流出，而具有相同电荷的离子则与树脂上交换基团进行离子交换并被吸附到柱子上，随后改变条件，用适当的溶剂从柱子上洗脱下来，即可实现物质的分离。 （5）应用：具有不同电荷和相同电荷的混合物,用于不同电荷离子的分离,小结：,一、吸附色谱 硅胶、氧化铝、聚酰胺 二、分配色谱 正相、反相 三、凝胶色谱 Sephadex G、 Sephadex LH-20 四、离子交换色谱 阳离子交换树脂、阴离子交换树脂 原理？溶剂系统？适合分离的化合物？洗脱顺序？,第三节 天然产物结构鉴定,一、纯度分