豚鼠过敏试验与中性粒细胞吞噬功能实验(小吞噬).ppt

主讲：张莉莉 E-mail:sqjcbwm 126.com 病原生物学与免疫学教研室,医学免疫学实验二,豚鼠过敏试验 The guinea pig allergic test,主讲：张莉莉 E-mail: zhanglili1912126com 病原生物学与免疫学教研室,掌握豚鼠过敏实验的原理；,一、实验目的,熟悉超敏反应的分类。,二、原理,速发型超敏反应,细胞毒型超敏反应,免疫复合物型超敏反应,迟发型超敏反应,型超敏反应又称为速发型超敏反应，是由特异性的IgE抗体介导的，其主要特征为： 出现快，消退也快； 出现功能紊乱性疾病，不出现严重组织细胞损伤； 有明显个体差异和遗传背景。,静息肥大细胞,激活后 5 分钟,激活后 60 分钟,荨麻疹,哮喘病发作患儿,先给豚鼠注射小量异种蛋白，经过一定的潜伏期，动物处于致敏状态。当第二次用较大剂量相同抗原注射豚鼠时，抗原激发豚鼠体内的肥大细胞或嗜碱性粒细胞，致使这些细胞释放多种生物活性介质，豚鼠迅速产生严重的过敏反应及至过敏性休克或死亡。,1、豚鼠：体重200g左右的幼小豚鼠； 2、变应原：马血清、鸡蛋清； 3、其他：生理盐水、无菌注射器、针头、碘酒、酒精、棉球等。,三、主要实验材料,四、实验步骤,1.取豚鼠三只，编号标记； 抓取方法：先用右手掌轻轻扣住豚鼠背部，抓住其肩胛下方，以拇指和食指抓住颈部将其轻轻提起。,2.致敏：按1：10分别稀释马血清，按照下表操作腹腔注射0.1ml。,第一次注射,1,2,3,马血清,生理盐水,马血清,3.发敏：按1：10分别稀释马血清，鸡蛋清，按照下表，心内注射2ml。,2-3周后第二次注射,1,2,3,鸡蛋清,马血清,马血清,豚鼠1在注射马血清1-5分钟会出现不安、抓鼻、喷嚏、呼吸困难、竖毛、大小便失禁、痉挛性跳跃，症状严重者在数分钟内死亡。 而豚鼠2、3无任何症状。,五、结果判断,将死亡豚鼠解剖，可见肺脏极度水肿，胀满整个胸腔。,1、心脏注射时，首先要固定好动物，然后于心跳最明显之处进针，感觉有搏动、注射器内有回血时再注射过敏原； 2、由于动物个体反应性不同，有的反应较轻，可幸免死亡。如果再注射马血清也不出现反应，此称为脱敏状态。但脱敏状态是暂时的，大约2周后又处于致敏状态。,六、注意事项,中性粒细胞吞噬功能实验(小吞噬）,熟悉中性粒细胞的吞噬作用原理和方法 通过本实验理解机体的非特异性免疫机制,一、实验目的,吞噬作用（phagocytosis）：是指细胞从周围环境摄取固体颗粒（如：微生物或较大的细胞残片）的活动。 血液中的中性粒细胞是一种小吞噬细胞，通过趋化、调理、吞入和杀菌等步骤，能吞噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物，是机体非特异性免疫的重要组成部分。,二、实验原理,吞噬细胞（phagocyte）：主要包括中性粒细胞（neutrophil）和单核吞噬细胞（mononuclear phagocyte）两类。,大吞噬细胞,吞噬细胞的分类,小吞噬细胞,大吞噬细胞,来源： 单核巨噬细胞 存在部位： 血液（单核细胞)、全身结缔组织及小血管的基底膜组织（巨噬细胞） 功能基础： 富含溶酶体及线粒体 功能： 吞噬病原微生物（寄生虫等），死亡细胞 反应时间及寿命：反应时间长（48h），寿命长,小吞噬细胞,来 源： 血液的中性粒细胞 存在部位： 血液、炎症部位（全身） 功能基础：溶酶体，过氧化物酶及杀菌物质 功 能：主要吞噬化脓菌 反应时间及寿命：反应时间短，数分钟到几小时，寿命短，平均数小时,吞噬过程示意图,中性粒细胞的吞噬作用,吞噬过程,1、无菌肉汤，白葡菌液，PBS缓冲液，瑞氏-姬姆萨染液。,2、注射器,解剖器材,玻片,显微镜等。,三、实验器材,1.诱导：实验前1小时给小白鼠腹腔注射(头低位、曲形进针)无菌淀粉肉汤2ml，诱导浆液渗出。 2.注射：给小白鼠腹腔内注射白葡菌液1ml，轻揉腹部，让小鼠活动。 3.取样：注射后30分钟处死小白鼠，抽取腹腔液涂片。 4.干燥：室温或者放温箱中完全干燥标本。,四、实验方法,5.瑞氏-姬姆萨染液染色： 滴加3滴A液于标本上，以完全盖住标本为宜，染色40秒。 滴加8滴B液，用洗耳球吹出微风使液面产生涟漪，使两液充分混匀，染色5分钟。 水洗（勿先倒掉染液，应以流水冲去）。 吸水纸拍干水分，干燥。 6.油镜镜检,五、实验结果,小吞噬,涂片应薄厚均匀适中，避免过薄或过厚。 瑞氏染液染色时间不能过长以免染色过重。,六、注意事项,附1：小白鼠的抓取和固定,通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，翻转后将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。,2.腹腔注射,腹腔注射：左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，酒精棉球消毒进针部位，右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿刺，针头刺入皮肤后进 针3mm左右，接着使注射针头与皮肤呈45角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后抵抗感消失。固定针头，保持针尖不动，回抽针 栓，如无回血、肠液和尿液后即可注射药液。,3.小白鼠的处死方法,颈椎脱臼法：用拇指和食指用力往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离，动物立即死亡。,4：油镜使用镜油的原理,光线丢失,光线保留,5.油镜的使用方法,低倍镜找到视野后，下降载物台，滴加香柏油，调节物镜使用油镜镜头，从侧面观察，用“粗调节器”上升载物台至物镜镜头浸入油内（有些镜头可以伸缩）；从目镜观察，用粗调节器下降载物台，