单克隆抗体技术及其应用-孟卫青.ppt

单克隆抗体技术及其应用,讲解人：孟卫青,单克隆抗体技术简介,一,二,三,四,五,单克隆抗体的制备过程,基因工程抗体制备技术,鼠源抗体人源化,六,七,抗人CD3抗体基本来源,基因工程抗体的广泛应用,已批准上市的治疗性单抗,培训大纲,1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 单克隆抗体（monoclonal antibody）：针对预定抗原的同一抗原决定簇的，高度同质的，且能保证无限量供应的抗体。 单克隆抗体技术的理论依据：抗体的多样性、克隆选择学说、抗体基因的重排理论、抗体结构与生物合成机制。,一.单克隆抗体技术简介,骨髓瘤细胞 （SP2/O-Ag14 ）：,1.1 单克隆技术的原理,丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT） 无法在HAT选择培养剂中生长 能无限地快速增殖 既不合成轻链又不合成重链,小鼠脾细胞 （B-Cell ）：,合成和分泌特异性抗体 无法进行体外长期培养,脾细胞SP2/O融合细胞：,HGPRT，能在HAT选择培养剂中生长 能无限地快速增殖 合成和分泌特异性抗体,HAT,次黄嘌呤，甲氨喋呤，胸腺嘧啶核苷,二.单克隆抗体的制备过程,2.1 单克隆抗体制备过程的注意事项,严格进行无菌操作，防止污染（细菌、霉菌、支原体、细胞） 根据实验的目标及时进行细胞的检测与筛选，（ELISA、 (酶联免疫吸附实验)IFA（时间分辨免疫荧光）、凝集、中和） 对筛选得到的阳性细胞克隆进行早期单克隆（有限稀释法） 在单克隆细胞建株过程中不定期验证检测 防止单克隆细胞过度生长 老化 死亡,细胞融合的方法：1、仙台病毒，2、PEG/DMSO，3、电融合,2、治疗试剂 病毒等微生物的中和抗体 抗毒素蛇毒、破伤风毒素，等 被动免疫治疗制剂 “生物导弹”，肿瘤治疗等,3、分子生物学研究工具 蛋白质等生物活性分子的纯化； 细胞生物学组织定位； 分子病毒学结构分析； 特定生物分子的功能研究；,诊断技术方法： ELISA（间接法、夹心法、竞争法） 免疫荧光法 胶体金 放射免疫法 ,2.2.单克隆抗体技术的应用,B,D,A,C,污染：培养环境、操作,抗体分泌不足：支原体污染、细胞突变、 培养体系有问题,融合细胞不生长：PEG、血清、HAT培养基,杂交瘤细胞难以克隆化：血清质量、细胞活性,2.3 单抗制备常见问题,三.基因工程抗体制备技术,鼠源抗体人源化,01,02,小分子抗体,03,抗体融合蛋白,3.1.单抗人源组分的分类,原核表达,抗体人源化,小分子抗体,双功能抗体,易于改造,亲和力成熟,产业化,3.2 基因工程抗体优点,抗体名称 抗体种类 靶向抗原 适应症 批准日期 OKT3 鼠单抗 CD3 移植排斥 1986 Panorex 鼠单抗 17-1A 大肠癌 1995 ReoPro 人-鼠嵌合Fab 血小板受体 冠心病 1994 Rituxan 人-鼠嵌合抗体 CD20 淋巴瘤 1997 Simulect 人-鼠嵌合抗体 CD25 移植排斥 1998 Remicade 人-鼠嵌合抗体 TNF- 炎症性肠病、 1998 类风湿关节炎 1999 Zanapax 人源化抗体 CD25 移植排斥 1997 Herceptin 人源化抗体 HER-2 乳腺癌 1998 Synagis 人源化抗体 RSV F蛋白 RSV感染 1998 Mylotarg 人源化抗体 - CD33 淋巴瘤 2000 Campath 人源化抗体 CD52 淋巴瘤 2001,四.已批准上市的治疗性单抗,就是利用DNA重组技术把鼠单抗的轻链、重链可变区基因 插入含有人抗体的恒定区域的表达载体中，并转入合适的宿主表达出来的抗体。 这样抗体即具有识别抗原的特异性，又减少了抗体的人抗鼠反应。,嵌合抗体,一.,改型抗体,二.,指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V） 中互补性决定区 （CDR）AA序列改换成鼠源单抗CDR序列，重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。,五.鼠源抗体人源化,可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达,5.1嵌合抗体,5.2嵌合抗体抗体制备简易图,六.抗人CD3抗体基本来源,关系图谱,1.CD3分子是T细胞的重要标志，由、和五种多肽链组成，它们的胞浆区均含有ITAM，具有传导TCR信号的功能，使T细胞活化。,2.从外周血、骨髓或脐血中分离出的单个核细胞在CD3单克隆抗体和多种细胞因子存在的条件下，经过一定时间培养可以获得具有肿瘤细胞杀伤活性的CIK（Cytokine-induced Killer）细胞,6.1 抗人CD3抗体与免疫细胞,1 .在肿瘤治疗方面的应用: 单抗药物抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不良反应。如2005年我国开发出癌症治疗药重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体(商品名：泰欣生)。泰欣生联合放疗治疗鼻咽癌的完全缓解率比单纯放疗的患者提高30%以上。 2 .在器官移植中的应用: 近年来 ,利用抗体药物作为实体器官移植的诱导治疗逐渐增加。如1986年批准进入美国市场的治疗性抗体类药物抗 CD3单抗即被用于肾、 心脏、 肝脏移植排斥的逆转。 3 .在心血管疾病方面的应用： 美国 FDA 于 1994 年批准了第一个人-鼠嵌合 Fab 抗体的上市，该抗体现已被广泛应用于多种心血管疾病治疗 ,主要用于预防冠状动脉成形术后的再狭窄 4 .在自身免疫性疾病方面的应用: 现有的研究表明 ,抗体对类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 牛皮癣、 多发性硬化、 硬皮病、 溃疡性结肠炎等疗效较好。,七.基因工程抗体的广泛应用,所以可行的方法就是在完善人抗体技术的同时，推进治疗性小分子抗体衍生物的研究，根据临床的实际设计灵活有效的治疗方案，使人源化抗体和小分子抗体互为补充。,7.1单抗未来发展的方向,01,02,抗体人源化以及完全人源化抗体的制备已经成为当今治疗性抗体的发展趋势，同时，各种抗体衍生物免疫原性低、更易通过血管壁到达病源，通过PEG化等方法可以延长其半衰期；,03,人抗体是否可以解决鼠抗体运用中出现的所有问题，还有待大量临床试验的检验。,01,减少降低了 机体的免疫排斥反应,02,募集效应因子或效应细胞,03,在体内的半衰期长,7