p66shc对机体寿命和疾病发生的影响

综 述p66Shc对机体寿命以及疾病发生的影响摘要：p66Shc蛋白Shc家族成员中的一员。研究发现，p66Shc是一种重要的调控细胞衰老的蛋白，可通过诱导多种类型细胞的凋亡和坏死促使机体老化，它的缺失则增强细胞对活性氧类物质的抗性并延长寿命。p66Shc在肾脏疾病中具有调控氧化应激、细胞凋亡、增殖和ECM产生等多重作用；p66Shc与糖尿病并发症的发生存在密切联系，如心脏损伤、内皮细胞功能紊乱等；p66Shc还是诱发正常细胞失巢凋亡的主要蛋白，p66Shc基因的表达失活与肿瘤转移密切相关。因此，p66Shc的研究对人类疾病的发生治疗等有重大的意义。关键词：p66Shc，Shc家族，机体衰老，细胞凋亡，肿瘤转移在哺乳动物中存在三种Shc基因，分别命名为ShcA，ShcB和ShcC,其中ShcA是研究最为深入的一种，人的ShcA基因定位于第1条染色体(1q21)，除大脑和神经元外在多个组织均广泛表达1。ShcA基因由于选择性拼接而产生两种mRNA，分别为p46Shc/p52Shc和p66Shc，后者是同一种mRNA由于翻译起始位点不同而产生的两种蛋白质。p66Shc、p46Shc和p52Shc三种蛋白质在结构上具有相同的3个功能域：N端磷酸丝氨酸结合结构域(PTB，中央富含脯氨酸结构域(CH1)和C端Src同源结构域(SH2)。而p66Shc比另外两种蛋白质在N末端还多出一个富含脯氨酸结构(CH2)，在p66ShcN末端的脯氨酸结构CH2区域，36（S36）位置包含了一个磷酸化的丝氨酸残疾末端，使得p66Shc作为感受器参加了酪氨酸激酶依赖的Ras激活作用，并因此获得了与p46Shc和p52Shc不同的功能1。即使它在p66Shc调节氧化应激和细胞凋亡、衰老过程中具有重要作用。1 p66Shc与细胞凋亡、机体寿命的关系p66Shc可调节活性氧的表达水平，从而影响细胞凋亡水平。研究结果发现，p66ShcA基因缺失的小鼠体内细胞对调节活性氧(ROS)的抵抗能力增加，由体外刺激(H2O2、NO、UV)引起的凋亡比正常对照少；相反，成纤维细胞内过表达p66Shc蛋白后比正常对照小鼠在体外ROS压力的刺激下凋亡数目增加2。而在正常的T淋巴细胞中p66Shc基因缺表达，如果人为地过表达p66Shc，则在预凋亡因子（包括H2O2，钙离子载体A23187等）的作用下，该细胞自发性和诱发性凋亡的程度则会明显提高3。因此，p66Shc蛋白作为一个细胞内ROS浓度高低的感受器，可以促进细胞凋亡，调节细胞寿命。1.1 p66Shc对线粒体的作用有迹象表明线粒体DNA单元型的变化与长寿的变化有关，即使是缺陷型的线粒体DNA，仍然可以在不同的核等位基因型的背景下发挥延长寿命的作用，这就证明了人类老化中线粒体可以扮演不同的角色。而研究表明5，在衔接蛋白p66Shc上的纯合子缺失会延长其寿命，以及由这些鼠得来的细胞表现出低水平的氧活性。研究者发现p66Shc的一部分就定位在线粒体上，并且拥有此基因型的成纤维细胞可改变线粒体的能量供应。p66Shc调控线粒体氧化能力，并通过把能量从氧化分配到糖酵解来提高寿命。细胞内ROS水平的持续升高会影响线粒体膜的极化，导致细胞膜通透性的改变和细胞色素的释放。环苞菌素A可以通过抑制p66Shc的表达来防止线粒体细胞膜通透性的改变，从而抑制由ROS引起的野生型小鼠胎儿成纤维细胞(mouse embryonic fibroblas,tMEF)的凋亡6，表明p66Shc是通过改变线粒体细胞膜的通透性来调控细胞色素C的释放，从而影响ROS的产生7，进而在体外ROS压力的刺激下使细胞的凋亡数目增加，控制机体寿命。1.2 p66Shc对氧化应激修饰的叉头蛋白的作用p66Shc蛋白调控细胞内ROS的能力与叉头蛋白家族的转录活性也有所联系。叉头蛋白转录因子家族成员包括促衰变加速因子16(DAF16)和哺乳类的叉头螺旋转移因子AFX和（FKHRL1）、FKHR等，它们定位在沉默细胞的染色体上积极参与与细胞分化增殖有关蛋白的编译，如过氧化氢酶，可以清除细胞内多余ROS7。对有延长寿命突变的线虫的遗传学研究证明，适当增加叉头蛋白的活性能延长寿命8。研究发现p66Shc-/-细胞中的依赖叉头蛋白的转录活性是增加的，它在导致强烈氧化应激反应的血清撤除时更明显。为证明氧化还原依赖的叉头蛋白的失活能被p66Shc调节，细胞被用外源性H202处理，野生型成纤维细胞在H202处理以后，FKHRL1的磷酸化快速和有统计学意义的增加，而p66Shc-/-细胞在氧化应激处理后FKHRL1的磷酸化无明显改变，不表达p66Shc的细胞。同时p66Shc-/-细胞在接受其他应激(如紫外线)刺激以后，FKHRL1的磷酸化也无明显改变。在表达突变的p66Shc的PC12细胞中也观察到类似的FKHRL1调节模式。在p66Shc缺失的成纤维细胞中重新表达野生型的p66Shc就可以恢复氧化应激诱发的FKHRL1的磷酸化8。这表明氧化应激引起的叉头蛋白磷酸化需要p66Shc的参与。2 p66Shc对疾病发生的影响2.1 p66Shc在肾病中的作用研究发现p66Shc-/-糖尿病小鼠蛋白尿，肾小球硬化，小球纤维连接蛋白和IV型胶原含量，血清晚期糖基化产物(AGEs)，血浆8异前列烷水平及NFkB活性明显低于野生型糖尿病组；p66Shc-/-系膜细胞在高糖刺激下ROS水平及NFB活性降低，细胞外基质(ECM)产生及细胞凋亡减少9。AGEs静脉注射后，与p66Shc-/-小鼠比较，野生型小鼠p66Shc-/-mRNA水平上调，有明显蛋白尿，小球肥大，硬化，细胞凋亡及ECM蛋白堆积，AGEs，血浆8异前列烷水平升高及NFkB活性增强10。说明p66Shc介导了糖尿病诱导的氧化应激及氧化应激依赖的肾脏损伤。还有研究表明11，中等浓度H2O2刺激肾小管上皮细胞EGFR活化，使其与p46/p52Shc，Grb2和SOS形成复合体，激活下游ERK，促进细胞存活；而高浓度H2O2诱导p66Shc Ser36磷酸化，与p46/p52Shc竞争结合Grb2，负调控EGFR/Ras/ERK途径，导致肾小管上皮细胞存活率降低。2.2 p66Shc在糖尿病中的作用 糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，也是糖尿病患者致死、致残的主要原因之一。有研究表明12，高糖不同时间段刺激对HK2细胞p66ShcmRNA的影响30mmol/L葡萄糖作用于不同时间点，Real-timePCR结果显示，高糖呈时间依赖模式上调p66ShcmRNA表达；而Western Blot结果显示，高糖呈时间依赖模式上调p66Shc蛋白的表达。通过观察30mmol/L高葡萄糖对HK-2细胞Ser36p66Shc磷酸化的影响，结果显示高葡萄糖处理后15min，磷酸化p66ShcSer36的蛋白表达量即明显高于对照组，且在90min达到高峰。这说明高糖可以同时诱导HK-2细胞p66Shc-Ser36磷酸化。进一步研究p66Shc在高糖诱导的线粒体ROS产生中的作用，应用p66Shc质粒转染HK-2细胞，发现p66Shc的瞬时高表达进一步促进高糖诱导的HK-2线粒体ROS的产生，提示p66Shc在高糖诱导的线粒体ROS产生过程中起重要作用。糖尿病是心血管疾病独立的危险因素，它可以加速动脉粥样硬化导致冠状动脉病变，同时糖尿病相关的心肌病也是心力衰竭的常见原因13。研究表明14，在链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠模型中，p66Shc-/-小鼠血管内皮组织过氧亚硝基阴离子生成减少，内皮细胞功能较正常对照组无明显改变，糖尿病对照组小鼠内皮细胞功能则明显降低，提示p66Shc蛋白在高糖导致的血管内皮细胞损伤过程中起关键作用，敲除p66Shc基因可以抵抗高葡萄糖介导的ROS依赖的内皮细胞功能紊乱。还有研究证实15，敲除p66Shc可以改善STZ诱导的小鼠心脏病理生理的改变，并且高葡萄糖可以诱导离体的心脏干细胞产生大量ROS，并发生凋亡；而从p66Shc-/-小鼠体内分离的心脏干细胞则未发现明显凋亡，提示p66Shc介导了高葡萄糖诱导的心肌细胞(包括心脏干细胞)的氧化损伤。2.3 p66Shc与肿瘤的关系 失巢凋亡具有重要的生理意义，细胞脱离基质黏附状态发生失巢凋亡，对机体发育和组织自身平衡起重要作用。失巢凋亡耐受或抑制是转移细胞的基本特性，与恶性肿瘤细胞转移和存活密切相关，可使肿瘤细胞在脱离与基质黏附状态时仍能存活16。研究发现17，p66Shc是一个通过RhoA相关的动力感觉神经元检测来报告细胞衔接的衔接蛋白。人的小细胞肺癌（SCLC）细胞和Lewis鼠肺癌(LLC)细胞在缺失p66Shc和PRB的情况下，会逃逸失巢凋亡，依然表现出高度转移的现象。而在体外重新导入p66Shc则会恢复失巢凋亡现象，并且还会为机体提供强有力的保护，防止LLC细胞的转移。在正常的上皮细胞中，p66Shc的失活导致非限制性Ras的激活，会通过RhoA下游的表达来逃逸失巢凋亡，相反的，LLC和SCLC需要通过重新导入p66Shc而绕过失巢凋亡，才能显示出构成的Ras活性。因此，p66Shc可以协调有关Ras的增殖和衔接的控制，来抑制肿瘤细胞的转移。但是，在前列腺癌记录的样品中，在前列腺癌性细胞中p66Shc的蛋白水平却比良好的腺细胞中p66Shc的蛋白含量明显增高。cDNA转染的生长水平低的LNCaP C-33细胞能动性的增加与前列腺癌细胞中p66Shc的高度表达有关，而且，LNCaPC-81和PC-33p66Shc前列腺癌细胞中p66Shc的表达水平以及肿瘤细胞的转移程度都比异种移植物动物体内的LNCaP-33细胞系高。相似的，p66Shc的表达水平在雌激素控制的肿瘤细胞中也是很明显高涨的，包括转移的胸腺癌细胞，卵巢癌细胞和乳腺癌细胞，还有甲状腺肿瘤细胞等。例如在乳腺癌的淋巴结位置超表达p66Shc也与淋巴结的转移有关17。相反的，ShcA水平的降低或者是显性失活的ShcA变异体的表达则会阻滞TGF（肿瘤生长因子）诱导的细胞能动性以及乳腺癌细胞中Neu/ErbB-2表达的侵袭。对具有高度转移能力的不同癌细胞系中p66Shc表达能力的研究结果表明，p66Shc作为一个影响肿瘤增殖和转移的蛋白，其有着潜在的肿瘤治疗靶点的重要作用。3 p66Shc的研究意义和前景随着对p66Shc的日益研究发现，p66Shc不仅是一种重要的衰老蛋白，可以通过对ROS的影响调节细胞凋亡，影响机体寿命，而且，p66Shc的表达还参与了肾脏疾病、糖尿病、癌症等的发生发展。它在肾脏疾病中的作用表明，p66Shc基因可成为肾脏疾病治疗的一个新的靶点，对其作用机制的进一步研究将对肾病的治疗开劈一条新的途径。p66Shc与糖尿病及其并发症的氧化应激密切相关,其机制主要是p66Shc作用于细胞线粒体产生大量ROS,与高血糖造成的氧化损伤关系密切。因此,对p66Shc的深入研究也有可能为治疗糖尿病及其并发症的治疗提供新途径。而对p66Shc与肿瘤细胞的广泛研究表明p66Shc影响肿瘤细胞的增殖和转移，了解该基因表达调控的分子机理可以为探索如何在不同的组织细胞中特异性的重新激活或敲出该基因提供理论依据，这无疑对于肿瘤的治疗具有重大的意义。参考文献1 Pellegrini M, Pacini S, Baldari CT. p66SHC:the apoptotic side of Shc proteinsJ. 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