《细胞传代》PPT课件.ppt

细胞传代,组织培养(Tissue culture)是在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使从体内取出的组织生存、生长繁殖和传代，并维持原有的结构和功能特性。广义的组织培养与体外培养同义。体外培养(Invitro)包括所有结构层次的培养，即：组织培养、细胞培养和器官培养。 所谓细胞培养(Cell culture)是指细胞包括单个细胞在体外条件的生长。,体外培养细胞的生存条件： 营养：体外培养细胞所需的营养物质与体内相同，主要有糖、氨基酸和维生素三大类。 环境 ：无菌，无菌是保证培养细胞生存的首要条件。温度，组织培养的最适温度为35-37，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。气体，气体也是细胞生存的必需条件之一。所需的气体主要有O2和CO2。 pH值，多数细胞的适宜pH值为7.0-7.4，偏离此范围对细胞可产生有害的影响。,体外培养细胞分型 离体培养细胞大多生长在甁皿等容器中，根据是否能贴附在支持物上生长，分为贴附型和悬浮型。,粘附:是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育 的基本存在方式 结果: 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面才能生存和生长,培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞 粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞,细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位,外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面；外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型,1、成纤维细胞型： 胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细 胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起,2、上皮型细胞： 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如： 皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆 形核 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状 生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动,3、游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 4、多型细胞型： 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,培养细胞形态不稳定 血清 Hela 高血清 低血清 成纤维细胞样 上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱 标准pH 成纤维细胞样 上皮样细胞 细胞密度 3T3 低密度 高密度 成纤维细胞样 上皮样细胞 生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮 贴附 圆形 成纤维或上皮样 转化与否 未转化 转化后 成纤维样 可成上皮样,悬浮型： 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。,体内细胞生长在动态平衡环境中，组织培养细胞的生存环境是甁皿等容器，生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新营养液，这一过程称传代（passage或subculture)。传代的频率与接种细胞数量、细胞生物特性以及营养液的性质等有关。 细胞“一代”仅指从细胞接种到分离再培养的一段时间，它与细胞世代或倍增不同。在细胞的一代中，细胞能倍增36次。,细胞传一代后，一般要经过三个阶段： 1游离期：即细胞接种后在培养液中呈悬浮状态的阶段，也称悬浮期 2.指数增长期：是细胞增殖旺盛的阶段，细胞分裂相多。 3.停止期：细胞数量已达饱和密度，细胞停止增殖，也称平顶期。,培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞可直接吹打传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。,操作步骤,选择生长良好的A549细胞一瓶，轻轻摇动培养瓶数次，悬浮起附着在细胞表面的碎片，然后连同培养液倒出，用D-Hanks洗1次。 加入消化液5滴，翻转培养瓶，使消化液浸没细胞。(一般消化时间为1到5分钟，镜下观察发现细胞质回缩，胞体变圆) 加入3mlD-Hanks液，轻轻吹打细胞生长面，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。,将细胞悬液移至15ml离心管中，1000rpm*5min离心。 去上清，加入新鲜的培养液轻轻吹打成悬液。 计数，分别接种在新的培养瓶内。可按1：2或1：3分配传代培养。,注意事项,1.严格的无菌操作。 2.胰蛋白酶要预温，温度37左右为宜。 3.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。 4.离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。,胰蛋白酶：主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。它在Ph8.0温度37时，作用能力最强。使用浓度一般0.25%。 EDTA:乙二胺四乙酸二钠，是一种化学螯合剂，对细胞有一定的解离作用，且毒性小，价格低廉，使用方便。使用浓度一般0.02%。,细胞冻存,细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 细胞低温冷冻储存是培养室常规工作和通用技术。,操作步骤,（一）细胞冻存 选用指数生长期的细胞，在冻存细胞前1天换液。 贴壁细胞用常规方法将细胞消化下来，收集单细胞悬液至15ml离心管中，然后离心（1000rpm，5min）。 弃上清，用冻存液混匀沉淀细胞，调整细胞浓度至（110）*106/ml,将细胞分装入冻存管中，每管1ml； 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1-2/ min；当温度达-25以下时，可增至-5-10/ min；到-100时，则可迅速浸入液氮中。,也可将装有细胞的冻存管放入4 冰箱30min,-20冰箱30min ，然后放入-70冰箱中过夜，最后移入液氮容器内,注意事项,1.待冻存的细胞应具有较高的活力。从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2.细胞不同，冻存效果不同。通常存活率可达90%以上。 3.常温下DMSO对细胞有毒副作用，因此应将冻存液在4 条件下放置40min以上才使用。 4.冻存液配方： 完全培养液90%+DMSO10%,DMSO:二甲基亚砜 ，一种透明、无色、无臭、呈微苦味的液体，毒性极低。是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成。,操作流程,选择生长良好的A549细胞一瓶，去旧培养液，加入D-Hanks1ml洗一次，去液体。 加入5滴消化液消化510分钟（镜下观察掌握），加入3mlD-Hanks液制成细胞悬液 将细胞悬液移入15ml离心管中离心（1000rpm 5min),去上清液，加入新鲜的培养液2ml重悬细胞 将1ml的细胞悬液加入原来的培养瓶中，再加入12ml的新鲜培养液，放入培养箱继续培养。 在剩余的1ml细胞悬液中加入100ul的DMSO,混匀后转入冻存管中 冻存（ 4 30min -2030min -70过夜 移入液氮内 ）,操作流程,选择生长良好的A549细胞一瓶，去旧培养液，加入D-Hanks1ml洗一次，去液体。 加入5滴