妊娠期高血压疾病医疗管理知识分析意义

类型：博士 硕士 同等学力人员学号：广州医学院研究生开题报告学科专业：妇产科学研究方向：产科课题名称：课题来源：研究生姓名：吴惠芬导师姓名职务：王晨虹 院长研究时间：年 月 日起年 月 日止说 明一、研究生开题报告是审核课题是否符合科学性、可行性的要求及学位论文进度计划，保证学位论文质量的有力措施，也是对研究生阶段考核。研究生在正式开题前都必须认真作好开题报告。二、研究生作开题报告，一般要邀请与本课题研究内容关系密切的相关学科专家教授35名参加。报告会由本科室主任或指导教师主持。三、经严格论证，对于选题合适，方法得当的可批准开题，对于尚有不足，必须按要求修改补充，必要时重新作论证报告。四、开题论证报告书中各项内容，都要实事求是，逐条认真填写。表达要准确。措词要简练，字迹要清楚易辨。五、封面上在“类型”的相应栏内打“”；“课题来源”指：国家级项目、省部级项目、市厅级项目、其他项目和自选项目等。六、除签名需要手写外，其他内容均可用电脑打印（A4纸，双面打印，中文字用宋体，数字和英文用Times New Roman字体），左侧装订。一、课题名称（包括分题）端粒酶逆转录酶与生存素在妊娠期高血压疾病中的表达及意义 二、选题依据（国内外研究概况、水平和发展趋势，开展此课题研究的设想、特色或创新之处，主要参考文献目录和出处）1、研究背景 妊娠期高血压疾病【1】（Hypertensive disorders in pregnancy）是妊娠期特有的疾病，其发生率为5%-8%。子痫前期不仅严重危及孕妇生命，还直接造成7%-8%的新生儿出生缺陷甚至死亡【2】。尽管其发病机理迄今未完全阐明，但对孕妇及围产儿的不良影响是肯定的，本文探讨在不同严重程度的子痫前期与正常妊娠的血小板反应蛋白、VEGF和sFlt-1的表达差异。2、国内外研究现状(1) 人端粒酶逆转录酶mRNA (human telomerase reverse transcriptase, hTERT mRNA)端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶,端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种自身携带模板的逆转录酶，RNA组分中含有一段短的模板序列与端粒DNA的重复序列互补，而其蛋白质组分具有逆转录酶活性，以RNA为模板催化端粒DNA合成，将其加在端粒的端，以维持端粒的长度与功能。人端粒酶由人端粒酶逆转录酶（hTERT）、人端粒酶RNA（hTR）、热休克蛋白90（hsP90）、P23、端粒酶相关蛋白1（TEP1）和角化不良蛋白（dyskerin）组成，其中hTERT是核心成分。【15】端粒酶活性的激活是阻止端粒重复序列缩短并使细胞获得永生性的必要途径。目前研究表明，在人正常的组织细胞中，端粒酶只存在于生殖细胞、造血干细胞和一些淋巴细胞中。由于端粒缩短与细胞老化有关，端粒酶在人类生殖中发挥着重要作用。【14】目前国内外对于人端粒酶逆转录酶与妊娠期高血压疾病的研究很少。国内仅杨华光等人研究发现，妊娠期高血压疾病患者外周血单个核细胞端粒酶活性增高。【3】Nishi H 等报道，hTERT在子痫前期患者胎盘中过度表达，其可能的机制是在缺氧状态下，hTERT启动子激活，是滋养细胞分化及发育受制，从而引起子痫前期的发病。【4】Geifman-Holtzman 等人利用RT-PCR检测发现妊娠期高血压疾病患者胎盘端粒酶mRNA水平增高，且与疾病严重程度呈正相关。其中重度子痫前期组比率为1.81，轻度子痫组1.63，正常对照组1.02,。【5】另外，Biron-Shental等也报道，子痫前期患者胎盘功能紊乱可能是由于端粒酶的缩短及聚合物形成，导致细胞的衰老及氧化应激，从而导致子痫前期的形成。【6、7】O Akutagawa等也报道，hTERT在子痫前期患者胎盘绒毛中被激活，其水平表达在子痫前期及妊娠早期比妊娠中、晚期显著升高。【8】近年研究多数表明，高血压病的细胞学本质是血管平滑肌细胞增生，以至血管壁增厚、管腔变窄、外周阻力增高，进而引起血压升高。子痫前期是妊娠期特有的并发症，其基本病理生理改变为全身小动脉痉挛。1945年，Hertig首次发现妊娠期高血压疾病患者子宫螺旋动脉早期变化之一是血管平滑肌细胞（VSMC）的增生活跃，进一步研究发现，妊娠期高血压疾病患者子宫螺旋动脉VSMC增生比急性动脉粥样硬化更常见，有的子宫螺旋动脉只表现为VSMC的增生而无动脉粥样硬化，有的仅表现为部分增生而无粥样硬化性改变。【9】Meekins的研究结果也支持妊高征患者子宫螺旋动脉VSMC增生的观点，并认为此改变类似于原发性高血压病小血管基本病理改变。【10】（2）生存素（survivin）生存素是迄今发现最强的凋亡抑制因子, 具有有调节细胞分裂的功能，在肿瘤细胞广泛表达。【11】妊娠高血压疾病是妊娠期特有的并发症，其病理特征是胎盘滋养细胞侵入子宫壁过浅, 导致胎盘缺血缺氧，影响滋养细胞浸润的因素很多, 其中凋亡机制可能是其重要原因之一。研究表明, 凋亡抑制基因蛋白生存素( survivin) 只在胚胎、胎儿以及肿瘤组织中有表达,在人成熟分化组织中表达缺乏。我们知道滋养细胞正常的分化、增殖、凋亡、迁移、浸润是胚胎着床及胎盘形成的关键。滋养细胞浸润过程失调将导致不孕、流产、妊高征、滋养细胞疾病等一系列病理过程。对胎盘的病理研究发现, 妊娠期高血压疾病患者普遍存在胎盘浅着床。这会导致胎盘缺血缺氧, 影响胎儿血供, 损害胎盘功能, 胎盘缺氧通过反馈作用削弱滋养细胞的浸润能力, 进一步促进妊娠期高血压疾病的发生。目前国内仅张树泉等人通过免疫组化检测发现，妊娠期高血压疾病患者及正常妊娠组胎盘组织中生存素均有表达，且通过定量分析，与正常组比较, 妊娠期高血压疾病组胎盘组织survivin 含量明显减少, 且在轻、重度妊高征组中递减。survivin 在妊高征患者胎盘组织表达减少,引发胎盘组织细胞的凋亡与增殖失调, 滋养细胞的凋亡占优势, 导致胎盘功能下降, 从而引发妊高征的一系列临床症候群。【12】张等人的报道与国外Allaire AD等报道与研究结果相一致。【13】Lehner R等报道，survivin及hTERT的表达在葡萄胎的胎盘组织中均升高，推测生存素及端粒酶对细胞的凋亡和端粒酶DNA的稳定化可能参与正常妊娠的发展。【16】目前已知生存素和端粒酶在不同环节影响细胞周期进程，生存素在细胞周期G2/M期高表达而逃逸凋亡关卡，通过有丝分裂促进细胞的异常增殖，端粒酶活性在G1/S期进行增加，并与S期达到最大，在G2/M期几乎测不到，两者可能通过不同的途径推动细胞增殖周期进程。【17】大量表达的生存素使SP1和c-myc在丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸化加强，磷酸化后结合于hTERT启动子能力加强，而加强hTERT的转录研究表明, 细胞凋亡与正常妊娠孕卵的着床及胚胎的发育有关。而在病理情况下, 细胞凋亡明显增多, 与多种妊娠并发症有关 。故推测生存素和端粒酶在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织表达,引发胎盘组织细胞的凋亡与增殖失调, 滋养细胞的凋亡占优势, 导致胎盘功能下降, 而引发妊娠期高血压疾病的一系列临床症候群。Endoh等发现，生存素大量表达可以通过增强hTERT转录从而增加端粒酶的活性。也有研究表明，生存素在肿瘤细胞中的功能同时也受到hTERT的调控，hTERT主要通过其表达量影响端粒酶的活性，从而特异地引起生存素的降解。但端粒酶的激活可能不完全依赖生存素的调控。【18、19】根据上述的研究，我们推测端粒酶和生存素之间可能存在某种相关关系，共同导致滋养细胞分化及发育受制，从而引起胎盘缺血或缺氧，使胎盘功能下降，引起妊娠期高血压疾病等一系列的病理变化。但是端粒酶及生存素在妊娠期高血压疾病发病机制的相互作用仍需进一步的研究。综上所述，鉴于目前国内外关于端粒酶与妊娠期高血压疾病的研究不多，能提供的参考文献有限。端粒酶活性及hTERT和有可能参与子痫前期的发病机制。本实验研究目的在于探讨hTERT mRNA和生存素对不同严重程度的子痫前期的发病机制影响，探讨端粒酶活性、hTERT mRNA和生存素3者之间与子痫前期的关系，并结合临床观察,希望做出有意义的探索,为临床早期诊断，早期治疗及判断子痫前期的预后提供新的依据。参考文献1、乐杰。妇产科学。第七版，北京：人民卫生出版社，2008:962、Chafez I, Kuhnreich I, Sammar M, et al, First-trimester placental protein 13 screening for preeclampsia and intrauterine growth restriction. 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A study of placental bed soiral arteries and trophoblast invasion on normal and sevsrs preeclamptic pregnancies. j Br J Obstet Gynecol. 1994.101;66911、Beardmore VA, Ah on en LJ, Gorbsk y GJ, et al . Survivindynamics in creases at cent romeres du ring G2/ M phasetran sition and is regulated by microtubule attachment and Aurora B kinase activity. J Cell Sci, 2004; 117( 18) : 4033- 404212、张树泉.訾思华. 妊娠高血压综合征患者胎盘组织生存素的表达及意义. 山东医药2005 (45)24:11-12 13、Allaire AD, Ballenger KA , Wells SR, et al . Placent al apoptos is in preeclampsia J . Obs tet Gynecol, 2000, 96( 5) : 271-276.14、Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR. Specific association of human telomerase activity, immortal cells and cancer.Science. 1994;/266:/2011_/5.15、Toshihiko. Naoko. et al. Expression of human telomerase reverse transcriptase and correlation with telomerase activity in placentas with and without intrauterine growth retardation. Acta Obstetricia et Gynecologica. 2006; 85: 3_/1116、Lehner R. Bobak J. et al. Localization of telomerase hTERT protein and survivin in placenta: relation to placental development and hydatidiform mole. Obstet Gynecol. 2001 Jun;97(6):965-70.17、Rodriguez JA. Span SW. Ferreira CG. et al. CRM1-mediates-nuclear export determines the cytoplasmic localization of antiapoptotic protein Survivin. Exp Cell Res.2002,275（1）：44-53.18、梅柱中,郑晓飞,董燕,等. 抑制端粒酶催化亚基的表达促进 Survivin 蛋白的降解. 癌症2005 ;24 :525 - 530.19、Endoh T, Tsuji N , Asanuma K, et al. Survivin enhances telomerase activity via up - regulation of specificity protein 1 - and c - Myc -mediated human telomerase reverse transcriptase gene transcription.Exp Cell Res 2005 ;305 :300 - 311.三、研究目的意义 本研究是一个病例对照研究，拟应用用TRAP-ELISA方法检测妊娠期高血压、轻度子痫前期、重度子痫前期及正常妊娠孕妇外周血端粒酶活性、RT-PCR检测胎盘人端粒酶逆转录酶信使RNA (hTERT mRNA)表达水平，免疫组化SP法检测胎盘中生存素（survivin）水平表达。探讨hTERT mRNA和生存素对不同严重程度的妊娠期高血压疾病的发病机制影响，探讨hTERT mRNA和生存素2着之间与子痫前期的关系，为临床早期诊断，早期治疗及判断妊娠期高血压疾病的预后提供新的依据。四、研究内容指标、技术路线及拟采取的研究方法（论述方法学的先进性、可能性及可靠性）1、研究目标：（1）探讨端粒酶活性、hTERT mRNA和生存素单独或联合应用对妊娠期高血压疾病的发病机制的影响。（2）探讨端粒酶活性、hTERT mRNA和生存素与妊娠期高血压疾病的严重程度关系。（3）探讨端粒酶活性、hTERT mRNA和生存素与不良妊娠结局的关系。：2、本项目创新之处：是国内外首个同时评价端粒酶活性、hTERT mRNA和生存素3个指标评价PE发病机制的研究，目前尚未有端粒酶活性、hTERT mRNA和生存素与妊娠期高血压疾病的相关性的研究，探讨3个指标 妊娠期高血压疾病的严重程度的关系及不良妊娠的结局的关系的相关研究。且本研究在RNA水平上研究妊娠期高血压疾病的发病机制，是一创新点。希望通过本实验研究能对妊娠期高血压疾病的临床早期诊断，早期治疗及判断妊娠期高血压疾病的预后提供新的依据。3、实验方法：3.1标本：收集2012.2.12012.5.1期间在我院住院诊断为妊娠期高血压、轻度子痫前期、重度子痫前期的孕妇各30例，确定为研究组，立即抽取静脉血5ml。及对照组（同期匹配年龄、孕周的正常妊娠的孕妇30例）。3.1.1 外周血标本：孕妇入院后未行任何治疗前抽取静脉血5ml，肝素抗凝，缓慢加入盛有Fioll-Hypague淋巴细胞分离液的离心管中，30min内 4无菌离心(12000r/min)20min，小心吸取白细胞层，离心后取细胞沉淀物于-80贮存待测。3.1.2免疫组化胎盘标本：孕妇分娩后，直视下取胎盘组织一块，约2*2cm2全层，以生理盐水冲洗干净表面的羊水及血液，立即置于10%福尔马林中固定，24小时内常规脱水、浸蜡、包埋。每例石蜡包埋组织常规连续切片4张，厚4m,涂于预先经多聚赖氨酸处理的载玻片上，室温干燥20min,60干烤20min，同批待测。3.1.3 RT-PCR胎盘标本：孕妇分娩后，直视下取胎盘组织一块，约2*2cm2全层，以生理盐水冲洗干净表面的羊水及血液，用剪刀将冲洗干净的胎盘剪碎，每个标本取约5小块的胎盘组织立即置于-80或液氮中保存，同批待测。3.2所需试剂（厂家及批号）：3.2.1 RT-PCR相关试剂盒及仪器3.2.2 端粒酶活性检测的相关试剂盒3.2.3. 免疫组化试剂盒、相关的试剂及辅助试剂3.3仪器或设备：酶标仪、离心机、恒温箱、洗版机、振荡器、磁力搅拌器显微镜等。3.4辅助设备：蒸馏水、加样器及匹配的枪头等。3.5具体实验步骤：3.5.1用TRAP-ELISA方法检测妊娠期高血压、轻度子痫前期、重度子痫前期及正常妊娠孕妇外周血端粒酶活性、RT-PCR检测胎盘人端粒酶逆转录酶信使RNA (hTERT mRNA)表达水平，免疫组化SP法检测胎盘中生存素（survivin）水平表达。3.5.2 均严格按照试剂盒说明书进行操作，尽可能将风险降至最低。4.数据处理使用正确的统计学方法，实验数据用SPSS 13.0统计软件分析五、主要技术关键及解决途径（包括协作要求）正常妊娠组妊娠期高血压组轻度子痫前期组重度子痫前期组1、 TRAP-ELISA方法检测4组外周血中端粒酶活性、RT-PCR检测胎盘hTERT mRNA水平表达2、 免疫组化SP法检测4组胎盘组织中生存素水平表达3、1、比较妊娠期高血压、轻度、重度子痫前期组与正常妊娠组3种物质水平的表达是否有差异2、比较妊娠期高血压组、轻度子痫前期组和重度子痫前期的3种物质水平的表达是否有差异统计整理分析数据，拟用2检验和秩和检验3.子痫前期诊断参照乐杰主编的妇产科学第7版标准。所有的病例均为单胎妊娠，既往无高血压，心脏病、肾病、糖尿病、结缔组织病及甲状腺亢进等病史。对照组是正常孕妇无妊娠并发症及合并症，胎儿亦正常，对照组严格匹配孕周、年龄、标本保存时间。4.应用正确的统计学方法整理分析数据。5.撰写论文。六、研究进度及预期达到的指标1、研究进度：1.1 2012-32012-6收集及完成所需标本的初步制作。1.2 2012-72012-11开始预实验及正式实验。1.3 2012-122013-2 观察结果，统计分析以及撰写论文。1.4 2013-32013-5 准备论文答辩的各方面需要。2、预期达到的指标：2.1妊娠期高血压、轻度子痫前期、重度子痫前期较正常妊娠孕妇外周血端粒酶活性升高、人端粒酶逆转录酶信使RNA