CD146促肝炎-肝癌恶性转化的作用机制

密级密级: 硕士硕士学位论文学位论文 CD146 促促肝炎肝炎-肝癌肝癌恶性恶性转化转化的作用的作用机制机制 作者姓名作者姓名： 江孝青江孝青 指导教师指导教师: 许瑞明许瑞明 研究员研究员 阎锡蕴阎锡蕴 院士院士 上海上海科技大学科技大学 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 学位类别学位类别: 理学理学硕士硕士 学科专业学科专业: 细胞生物学细胞生物学 研究所研究所: 中国科学院上海生命科学研究院中国科学院上海生命科学研究院 2017 年年 6 月月 The mechanism of CD146 on promoting malignant transformation of hepatitis to hepatocellular carcinoma By Jiang Xiaoqing A Dissertation/Thesis Submitted to The University of Chinese Academy of Sciences In partial fulfillment of the requirement For the degree of Master of cell biology Shanghai Institutes for Biological Sciences, CAS June, 2017 中科院上海生命科学研究院中科院上海生命科学研究院 研究生学位论文声明研究生学位论文声明 本人郑重声明： 1. 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所 取得的成果。除文中已经注明引用的内容或属合作研究共同完成的工作外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 2. 所呈交的学位论文，实验结果均由相应的实验数据分析得出，实验 数据真实可靠。 该声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 研究生学位论文版权使用授权声明研究生学位论文版权使用授权声明 本人完全了解并同意遵守中科院上海生命科学研究院有关保留、 使用学位论 文的规定，即：上海生命科学研究院有权保留送交论文的复印件和电子文件，并 提供论文的目录检索及借阅、查阅；上海生命科学研究院可以公布论文的全部或 部分内容，可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编本学位论文。保密的论文在解密后遵 守此规定。 作者签名： 导师签名： 日期： 致谢致谢 首先，感谢许瑞明老师给我进入中科院生物物理所学习的机会，感谢他在 我研究生期间给予我学业上的各种帮助。同时，能够成为阎锡蕴老师实验室的 一份子，我感到非常荣幸。在这几年的科研工作和学习过程中，阎老师给予我 耐心的指导与深切的关怀。科研上，阎老师帮助指导课题研究方向，提供丰富 的科学平台，让我在自由探索的同时能够接轨科学前沿与临床应用；生活中， 阎老师更是言传身教，教导我们待人接物，帮助提升个人素质。阎老师无微不 至的关怀让我非常感动与感谢！阎老师对待科研与生活的热情是我学习的榜 样。虽然研究生生活短暂，但我相信这几年的经历将使我受益一生。 其次， 非常感谢我们实验室大家庭的每位成员！ 感谢你们对于我学习和生活 的各种帮助，尤其是段红霞师姐。初入实验室，是你带领我学习各种实验技术， 帮助我迈向科研之路的第一步。遇到困难，你不厌其烦的帮助我克服，与我携手 前进。正因为有你，课题才能如此顺利的进行。生活中，你时常组织聚餐，帮助 师弟师妹联络感情，促进集体凝聚力。无论是科研工作还是生活，你都给予我非 常多的帮助。感谢你的包容、耐心与对课题和毕业论文的指导。此外，感谢杨东 玲老师、冯静老师、王兆卿老师、刘铮老师、郑继燕老师、段德民老师、张德玺 老师、王飞老师等众位老师给予我课题和生活的关心与帮助。感谢刘丹师姐、高 倩师姐、吴真真师姐、晏荟文师姐、陈佳楠师姐、马艳彬师兄、张建林师兄、周 萌、熊朝亮、王大吉、赵帅、江冰、梁倩、王培霞、景林、丁军、徐庆吉等实验 室的小伙伴们对我科研工作和生活带来的帮助与欢乐。 感谢王玉春师傅每天辛苦 工作为我们建立干净而又整洁的实验环境，带来漂亮的花朵。 感谢中国科学院生物物理所的杨鹏远老师帮助指导课题方向。 感谢生物物理 研究所秦志海老师与他实验室的宋坤、李亚男、刘海洋、马盼等同学对我实验上 的帮助。 感谢陈晶晶老师对我学业上的各种关心与帮忙。 感谢生物物理研究所科 学平台的老师们为我的课题提供良好的技术平台。 感谢上海科技大学陈斯国老师、 章博老师、孟祥老师对我学业的帮助。感谢评审老师对我论文的指导和修正。 感谢我的家人这些年来一直陪伴在我身边，给予我无微不至的关怀！ 江孝青 2017 年 6 月 中文摘要中文摘要 肝癌是世界第三大癌症，也是我国高发和危害极大的肿瘤。尽管肝癌来源于 慢性肝炎的恶性转化这一观念已被普遍接受，然而，目前对肝炎-肝癌恶性转化 的机制研究虽略有成效，但仍缺乏针对连续病变阶段的动态研究。本研究基于前 期发现 CD146 是非可控性炎症关键节点分子进一步展开，旨在阐明 CD146 在肝 炎-肝癌恶性转化中的作用，探索调控肝炎-肝癌转化的机制，从而为临床治疗提 供新的理论依据。 为了探索 CD146 对肝炎-肝癌转化的作用与机制， 我们构建了四种 CD146 全 身或条件性敲除小鼠以及两种肝炎肝癌小鼠模型（即四氯化碳（CCl4）诱导的肝 硬化模型和二乙基亚硝胺-四氯化碳（DEN- CCl4）联合诱导的肝癌模型） 。在肝 硬化模型中，我们发现，CD146 全身敲除（CD146KO）并不影响肝硬化的进程； 相反，靶向 CD146 的功能性抗体 AA98 可明显减轻小鼠肝硬化症状，提示在肝 硬化进程中可能存在 CD146+ 促炎和抑炎两群细胞，AA98 能阻断促炎细胞群的 功能或者上调抑炎细胞群功能。在肝癌模型中，CD146KO 小鼠的肝癌发生率明 显降低，提示在肝硬化向肝癌转变过程中 CD146+ 抑炎细胞群发挥着主要作用。 为进一步明确抑炎细胞群的类型,我们又分别利用三种 CD146 条件性敲除 小鼠构建肝癌模型，包括内皮细胞特异性敲除（CD146 EC-KO） 、T 细胞特异性敲 除（CD146 T-KO）及巨噬细胞特异性敲除（CD146 M-KO） ，结果发现肝癌发生率均 无明显变化， 提示在肝癌发生过程中可能存在其它促癌性 CD146+ 细胞群。 随后， 通过流式细胞术发现，肝癌小鼠中存在髓样来源抑制性细胞（MDSC）的两种亚 型，即 CD146+ MDSC 与 CD146- MDSC。更有意义的是，我们发现随着肝硬化进 展，CD146+ MDSC 比例上调，而在经过 CD146 抗体治疗后比例明显下调，提示 CD146+ MDSC 是促进肝硬化进展的促炎细胞群。这一上调现象在小鼠肝癌模型 中同样得到验证， 提示 CD146+MDSC 是促进肿瘤发生的抑炎细胞群。 综上所述， CD146+ MDSC 与肝硬化及肝癌的发生呈正相关：即在肝炎中促炎、在肝癌中抑 炎，提示 CD146+ MDSC 是炎-癌转化的关键节点，MDSC 通过 CD146 动态调控 其功能促进肝炎-肝癌恶性转化，CD146 可作为肝炎-肝癌恶性转化的治疗新靶点。 关键词：关键词： 肝炎；肝肝炎；肝硬化；硬化；肝癌肝癌；CD146；CD146+ MDSC ABSTRACT Hepatocellular carcinoma (HCC) is the worldwide problem, especially in China. It has been recognized as a malignant transformation from chronic hepatitis, however, the link from chronic hepatitis-to-HCC is still elusive. Based on our previous result that adhesion molecule CD146 is a key point in the nonresolving inflammation, this study is aimed to explore the function and mechanism of CD146 on the malignant transformation from hepatitis to HCC, and provide a new target for the clinical treatment of HCC. In order to explore the role of CD146 on the transformation from hepatitis to HCC, we constructed four kinds of CD146 systemic or conditionally knockout mice and established two animal models, that was carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver cirrhosis and diethylnitrosamine-carbon tetrachloride (DEN-CCl4) induced HCC model. In the cirrhosis model, we found that systemic knockout CD146 (CD146KO) did not affect the process of cirrhosis; on the contrary, the functional anti-CD146 antibody AA98 can significantly alleviate the symptoms of liver cirrhosis in mice, suggesting a balance of two CD146+ cell subsets (pro- and anti-inflammatory) in the process of cirrhosis, and AA98 can block the function of pro-inflammatory cell or enhance the function of anti-inflammatory cells. In HCC models, CD146KO significantly inhibits the incidence of HCC, suggesting that CD146+ anti-inflammatory cell subsets played a major role in the transition of liver cirrhosis to HCC. To further clarify this anti-inflammatory cells type, we then established HCC models in endothelial cell conditional knockout CD146 (CD146EC-KO), T cell conditional knockout CD146 (CD146T-KO) and macrophage conditional knockout CD146 (CD146M-KO). The results showed that there was no significant difference in the incidence of HCC in these mice, implying there might be other carcinogenic CD146+ cells in the process of HCC. By using flow cytometry, we found that there were two subtypes of myeloid-derived suppressor cells (MDSC) in the HCC mice, namely CD146+ MDSC and CD146- MDSC. More importantly, we found the proportion of CD146+ MDSC was increased with the progress, while significantly reduced after anti- IV CD146 antibody treatment, suggesting that CD146+ MDSC is a proinflammatory cell population that promotes progression of cirrhosis. Similar results were observed in HCC models, indicating that CD146+ MDSC is an anti-inflammatory cell population that promotes tumorigenesis. Altogether, the results suggest that CD146+ MDSC is positively correlated with the occurrence of liver cirrhosis and HCC, that is, it is pro- inflammatory in hepatitis and also promote cancer in HCC, which indicates that CD146+ MDSC is the key point in hepatitis-hepatoma transformation, CD146 promotes the function of MDSC in the malignant transformation from hepatitis to HCC and can be used as a new target for the treatment of this malignant transformation from hepatitis to hepatoma. Key words: Hepatitis；Liver cirrhosis；Hepatocellular carcinoma；CD146；CD146+ MDSC V 目录目录 第第 1 1 章章 引言引言 - 1 1 1.1 肝硬化与肝癌概述 1 1.1.1 肝癌病因与流行病学 1 1.1.2 肝硬化发生的免疫学基础 2 1.1.3 肝硬化的治疗现状 5 1.1.4 肝癌发生的免疫学基础 7 1.1.5 肝癌的治疗现状 9 1.2 髓样来源的抑制性细胞 10 1.2.1 MDSC 的来源与趋化 10 1.2.2 MDSC 的免疫抑制功能 11 1.2.3 MDSC 与肝脏疾病密切相关 14 1.3 CD146 与免疫系统 15 1.3.1 CD146 概述 . . 15 1.3.2 CD146 与免疫密切相关 16 1.3.3 CD146 与肝脏疾病 18 1.4 研究目标与内容 19 第第 2 2 章章 实验材料与方法实验材料与方法 - 2121 2.1 实验材料 21 2.1.1 实验动物与细胞系. 21 2.1.2 主要试剂 21 2.1.3 主要仪器耗材 22 2.2 主要实验方法 23 2.2.1 动物模型诱导 23 2.2.2 小鼠肝脏组织 H APC, 抗原呈递细胞; BTLA, B,T淋巴细胞 衰减子; CAF, 肿瘤相关成纤维细胞; CTLA-4, 杀伤性T淋巴细胞蛋白4; CXCL12, 基质细胞 8 第 1 章 引言 来源因子; CXCR4, C-X-C 趋化因子受体4; DC, d树突状细胞; ECM, 细胞外基质; EGFR, 上 皮生长因子受体; HCC, 肝癌; HVEM, 疱疹病毒侵入介质; IDO, 吲哚胺2,3双加氧酶; LAG-3, 淋巴细胞活化基因3; NK, 自然杀伤细胞; MDSC, 髓样来源抑制性细胞; MMP, 基质金属蛋 白酶; PD-1, 程序性死亡蛋白1; PD-L1, 程序性死亡蛋白配体1; PDGF, 血小板来源生长因子; PGE2, 前列腺素 E2; ROS, 活性氧系列; TAA, 肿瘤相关抗原; TAM, 肿瘤相关巨噬细胞; TCR, T细胞受体; TGF-, 转化生长因子; TIM-3, T细胞免疫球蛋白-黏蛋白包含蛋白3; T reg cell, 调节性T 细胞; VEGF, 血管内皮生长因子. 1.1.5 肝癌的治疗现状 相对于常规手术、化疗、放疗的 HCC 治疗手段，免疫疗法是病人在手术后 降低复发风险的最佳选择，有助于延长生存期，控制肿瘤生长 45。许多实验室已 试验过基于HCC 机制研究的治疗， 但靶向单一分子的治疗效果都不明显， 如 IFN- ,IL-12 等 48-50。这是由于 HCC 的发生发展多由遗传和环境因素相互作用，多诱 因、多基因参与，多步骤调控的复杂过程，单一分子的效应很容易被其他分子补 偿，所以从细胞层面考虑收效会更佳。现今应用较好的免疫细胞技术包括 CIKs （多种细胞因子诱导的杀伤细胞）和 CART。其中，CIK 更接近体内状态，因此 前景更广大。CIKs 来源于外周血单核细胞，经过体外与多种细胞因子（IFN-， IL-1，IL-2）和 CD3 抗体共培养一段时间后得到的一群异质性细胞。其增殖能力 强，方便获取，且属于自体免疫疗法，无排斥现象 45。因此，是现今肿瘤治疗的 “新宠” 。但至今，该技术仍未有 HCC 的相关临床数据。 考虑肝癌治疗策略时，还需要思考几个关键问题。首先，现今发现的信号分 子，如表皮生长因子，肿瘤血管生成相关因子等，均为多种癌症共有，并非肝癌 特异，因为不同肿瘤的敏感性不一样，应用后疗效可能不一致。另外，我们还应 考虑肝癌病灶本身的特殊性。因为肝脏功能代谢与其他脏器不同，一些靶向药物 进入肝脏后一方面可能对肝脏产生毒性， 另一方面可能会被代谢分解， 失去效应。 这是很多药物在肝癌临床试验中失效的原因。 目前为止只有索拉非因可以延长肝 癌病人生存期 51, 52。很多其他药物在期研究时效果很好，但是临床研究结果并 不理想。因此，HCC 基础研究需要更加深入细致，方能全面高效的制定有效的 治疗策略。 9 CD146 促肝炎-肝癌恶性转化的作用机制 1.2 髓样来源的抑制性细胞 髓样来源的抑制性细胞 MDSC（myeloid-derived suppressor cells）于上个世 纪 70 年代末被发现， 是一群骨髓来源的抑制性细胞， 具有抑制免疫应答的功能。 近几年，MDSC 的功能机制研究发展迅速，每年均有约 500 篇相关文章发表，目 前它已俨然成为免疫界的“新星” 。 1.2.1 MDSC 的来源与趋化 1978 年，耶鲁大学科学家 Mitchell .M.S 和 Rao .V.S 在小鼠体内通过卡介 苗注射发现一群区别于 B、T 等其它已知免疫细胞的亚群，命名为 NS（natural suppressor）细胞 53，并且可能执行免疫抑制功能。随后，其它科学家陆续在异体 移植及疾病模型中验证了它对免疫系统的抑制效应 54, 55。 直至 1998 年，人们发 现其重要标志物 Gr1, 由此正式以 CD11b 和 GR1 作为小鼠 NS 细胞亚群的表型 标记物 56, 57。之后通过细胞学和基因表达的不同发现 MDSC 的异质性，并根据 GR-1 分子的两个亚型表达高低，将其区分为两个亚群 CD11b+Ly6G+ (G-MDSC) 和 CD11b+Ly6G-(M-MDSC)。G-MDSC 被称为粒细胞样 MDSC，细胞胞浆含多颗 粒； M-MDSC 被称为单核样 MDSC， 细胞属单核形态， 类似单核细胞。 人体 MDSC 表型与动物中不同， 为 CD33+CD11b+， 它可通过 CD14 和 CD15 的表达分为两个 亚群，G-MDSC 为 CD33+CD11b+CD15+，M-MDSC 为 CD33+CD11b+CD14+58-60。 MDSC 由骨髓造血干细胞 HSC 发育而来，正常生理状况下称为 IMC （immature myeloid cells） ，是一群具有分化能力的前体细胞，可继续分化为巨噬 细胞，树突状细胞和单核细胞，维持免疫系统稳态。此时，IMC 并不具备抑制功 能。MDSC 是病理情况下 IMC 获得免疫抑制功能后的一群细胞。因为病理条件 下，如急性或慢性炎症，病毒感染以及肿瘤情况下，骨髓中 IMC 受到外周免疫 环境的调节，发生命运改变，失去向下分化的能力，转而获得抑制功能，并在在 趋化因子作用下迁移至病灶和外周淋巴器官发挥作用。 因此， MDSC 的扩增是机 体免疫稳态失衡的体现。 炎症，病毒感染或是肿瘤条件下，外周血，脾脏以及病灶部位 MDSC 明显 增加， 该现象可能与疾病严重程度呈正相关。 相关文献报道， 肿瘤细胞分泌的GM- 10 第 1 章 引言 CSF 和 G-CSF 可直接或者间接促进 MDSC 的趋化和迁移。 2003 年 Bendell.L.J 实 验室对小鼠采用 CXCR4 拮抗剂， 抗体或者过表达 CXCL12 后发现外周血 MDSC 数量明显上升。而 CXCR4 信号的阻断对于 G-CSF 诱导的 MDSC 的募集有重要 作用 61。文献数据显示 CXCL12 对髓样细胞趋化有着重要作用。CXCL12 或者 CXCR4 敲除小鼠无法建立正常骨髓环境而会导致新生死亡 62。1995 年，Pak. AS 发现头颈癌中的肿瘤细胞分泌的 G-CSF 可上调肿瘤部位具有天然抑制功能的细 胞 63，之后其他科学家亦发现肿瘤细胞分泌的 G-CSF 与 GM-CSF 都能促进骨髓 来源抑制性细胞增长 64, 65。2010 年的一篇报道显示，G-CSF 可通过调动 MDSC 促进肿瘤向肺部转移， 并且通过 G-CSF 抗体治疗可明显抑制这种调动作用。 2011 年， 有报道发现不同肿瘤分泌 G-CSF 水平的不同可影响肿瘤中 G-MDSC 的累积， 以及调控粒细胞生成和动员中性粒细胞。由此可见，G-CSF 对于 MDSC 的趋化 或者增殖有重要的作用 66。GM-CSF，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子因子，也可 调控 MDSC。 许多可分泌 GM-CSF 的移植瘤模型显示， 将肿瘤细胞系中 GM-CSF 基因敲除之后可显著改变肿瘤生长过程中 MDSC 的数目和亚群分布 67。一致的 研究也发现， 采用 GM-CSF 和 G-CSF 的中和性抗体同样能抑制 MDSC 的累积和 募集，从而抑制肿瘤进展 66。CXCL1，chemokine ligand 1，属于 C-X-C 家族趋 化因子，其配体为 CXCR2，可由单核细胞，巨噬细胞，肿瘤细胞等多种细胞分 泌。2013 年，Kapanadze 等人研究发现，无论是 DEN 诱导的原位肝癌模型还是 皮下 RIL-175 细胞系荷瘤模型， 都能引发肝脏 MDSC 累积， 并伴随肝脏中 CXCL1 mRNA 表达水平的升高；且 CXCL1 的升高只与肝脏 MDSC 相关，而非肿瘤部 位，推测 CXCL1 水平特异与肝脏中 MDSC 累积相关 68。 1.2.2 MDSC 的免疫抑制功能 经过 30 多年的研究，人们发现 MDSC 可通过多种途径抑制机体免疫 69, 70。 首先，MDSC 可通过 Arg1 和 iNOS 抑制 T 细胞增殖与功能发挥。已有研究 表明，慢性炎症和肿瘤环境下，MDSC 在病灶积累，并上调表达 Arg1（精氨酸 酶 1）和 iNOS（诱导型一氧化氮合酶）。Arg1 促使 L-精氨酸分解，使微环境中 这种非必须氨基酸减少，从而促使 T 细胞上 CD3 链低表达，阻碍 TCR 正常信 号传导，影响 T 细胞自身增殖 71。除此之外，研究发现 L-精氨酸的缺少还可能 11 CD146 促肝炎-肝癌恶性转化的作用机制 通过抑制 T 细胞上调表达周期调节蛋白 D3 以及细胞周期蛋白依赖的激酶-4 实 现 72。同样，iNOS 也可消耗 L-精氨酸来抑制 T 细胞功能，且生成的 NO 可通过 非血红蛋白还原酶和抑制钙通道来影响 T 细胞增殖 73。 其次，MDSC 可下调 NK 细胞表面活化受体 NKG2D 来抑制 NK 细胞的杀 伤活性。NKG2D 是 NK 细胞重要的活化受体，实验证明 MDSC 与 NK 细胞共培 能明显下调 NK 细胞上 NKG2D 的表达以及杀伤活性，而这是通过 MDSC 上膜 结合型 TGF- 实现的 74。 再者，MDSC可通过分泌抑制性细胞因子IL-10，TGF-发挥抑制作用。IL- 10是一种多功能负性调节因子, 其参与MDSC的免疫功能的机制可能包括:（1） IL-10可诱导未成熟的辅助性T淋巴细胞(Th0)向Th2细胞分化, 抑制Th1细胞的 生成。Th2细胞产生的IL-4、IL-6、IL-10都可直接刺激肿瘤细胞生长,促进肿瘤细 胞和MDSC产生更多的IL-10。 （2）IL-10能抑制单核/巨噬细胞系统产生IL-1、IL- 12、TNF-、GM-CSF，抑制T 细胞及NK 细胞产生TNF-、IFN-, 并促进单核/ 巨噬细胞系统、T细胞和NK细胞产生IL-10。 （3）IL-10能抑制各种抗原递呈细胞 (APC)对抗原的趋化反应, 并抑制APC 膜上MHC、类分子及CD80、CD86等 的表达,从而抑制了APC向T细胞递呈抗原。而TGF-参与MDSC的免疫功能的机 制可能包括如下:可以促使Th1/Th2平衡向Th2细胞方向偏移；可以抑制CTL 和NK细胞CD3中链信号的传递,抑制链及细胞质中蛋白酪氨酸、丝氨酸、苏氨 酸的磷酸化,故抑制相应转录因子的活化； TGF-可抑制IFN-及MHC类分子 合成66, 69, 70, 75, 76。 此外， MDSC可诱导Treg细胞的产生。 研究指出， 在1D8卵巢癌荷瘤小鼠中， MDSC介导的Treg产生依赖于MDSC上CTLA4（cytotoxic lymphocyte antigen 4， 也称为CD152） 的表达77。 在另外的淋巴瘤小鼠模型中则发现这一作用有Arginase 1的参与78。同时，另外一些肿瘤模型中还证实该作用依赖于肿瘤相关T细胞的活 化与细胞因子IFN-和IL-10的存在。当然，也有学者持有相反观点。因为他们发 现在肿瘤发展不同阶段Treg的数目差异很大，与MDSC的动态变化无直接相关性。 有实验结果显示，在大鼠肾脏移植模型中，共表达CD80和CD86的MDSC根本无 法诱导Treg的扩张79。虽然仍然需要更多的数据去说明这些现象，但是人们仍然 倾向于MDSC可诱导Treg来发挥抑制作用的观点。 12 第 1 章 引言 图 1.2.270 MDSC在肿瘤和外周淋巴器官中的作用。 外周淋巴器官中， MDSC介导的免疫抑制 主要依赖特异抗原以及细胞间相互接触。其抑制机制多样化，包括活性氮活性氧NO, ROS, PNT的产生，T细胞关键营养分子（L-精氨酸，L-色氨酸，L-半胱氨酸）的清除，阻碍T细胞 归巢（通过表达ADAM17），分泌抑制性细胞因子（TGF-，IL-10）和诱导Treg产生。迁移 至肿瘤部位后，炎症和低氧环境诱导MDSC中HIF-1（低氧诱导因子1）介导的精氨酸酶1 与iNOS上调，ROS下调，抑制性分子PD-L1（程序性死亡配体1）上调表达，同时产生CCL4 与CCL5趋化Treg（调节性T细胞）进入肿瘤。NO，一氧化氮；ROS，活性氧；PNT；PNT： 过氧亚硝酸盐； TGF-， 肿瘤生长因子； IL-10： 白介素10； HIF-1， 低氧诱导因子1； iNOS， 诱导型一氧化氮合酶；PD-L1，程序性死亡配体1；Treg，调节性T细胞。 然而，有研究发现MDSC也能发挥抗肿瘤作用76。2001年，Blondineth Pelaez 等人研究发现，经过环磷酰胺处理的小鼠可诱导早期NS细胞（即MDSC）释放高 浓度的NO作用于T细胞，抑制肿瘤生长。已有证据显示NO具有两面性。高浓度 NO可通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肿瘤生长， 低浓度NO则可通过消耗精氨酸等机 制促进肿瘤发展80。因此MDSC抑制肿瘤发生的其中一个机制可能依赖于释放的 NO浓度的高低。另外，2008年Norman Nausch发现荷瘤小鼠中M-MDSC表达的 13 CD146 促肝炎-肝癌恶性转化的作用机制 RAE-1可刺激NK细胞分泌更多IFN-， 增强抗肿瘤效应81。 因为MDSC促肿瘤效应 的证据远多于抑肿瘤效应的， 所以人们更倾向于接受MDSC属于促肿瘤免疫细胞。 但基于已有研究， 我们仍然无法确定MDSC是否真的具有促炎功能？其何时何地 它能发挥促炎功能？其发挥促炎功能与抑炎功能的细胞是同一群吗， 还是不同细 胞间相互转化而来？这些有待更多的实验证明。 1.2.3 MDSC 与肝脏疾病密切相关 炎症和肿瘤发生发展中，MDSC 可发生大量扩增，并迅速累积至病灶部 位。多项研究发现，不同荷瘤小鼠，包括乳腺癌，肺癌，皮肤癌，不论有否发生 肝转移，都能发现肝脏中 MDSC 数目的增长，即 MDSC 在肝脏中特异性累积。 这其中涉及多种细胞类型与可溶性因子的参与 82。Ilkovitch et al 实验结果显示肝 脏中 MDSC 的累积部分依赖于 GM-CSF，它是一种可由多种类型肿瘤分泌的造 血生长因子，与 MDSC 在脾脏的累积相关。HSC 作为肝脏重要的非实质细胞， 除了具有脂质储存功能外，还能诱导 MDSC 进入肝脏。研究证明在人体中，这 种作用依赖于 HSC 上 CD44 的表达和细胞间的接触，而在小鼠中，则是依赖于 可溶性因子的作用。Chou et al 多项实验还发现 HSC 分泌的补体 C3 和 IFN- 信 号都在其中发挥重要作用。此外，相当多细胞因子也能促进 MDSC 进入肝脏发 挥作用。2013 年，Yen BL 发现人的间充质干细胞和骨肉瘤细胞可在体外诱导 MDSC（CD11b+CD33+CD14-）的扩增，而这种效应由 HGF（肝细胞生长因子） 和它的受体 c-Met 介导。通常，肝脏中 HGF 维持在较高水平，这也能解释为什 么生理条件下肝脏里也存在较多的 MDSC。事实上，抑制 HGF-cMet 信号的确可 下调肝脏中 MDSC 的数目而不影响脾脏 MDSC83。在多种微生物引起的败血症 中也发现，HGF 对于控制感染引发的炎症很有作用。另外，SAA（血清淀粉样蛋 白 A）和趋化因子 CXCL1 可协同促进 MDSC 从骨髓的迁移和脾脏的累积。这种 累积效应可因为SAA的缺失而减弱， 也可因为MDSC的过继转移和SAA/CXCL1 的体外注射而恢复。另一个有利于 MDSC 累积的分子是由活化的炎症小体分泌 的 IL-1/IL-1884。 那么，肝脏中累积的 MDSC 在肝脏疾病发生发展中发挥什么作用呢？多项 14 第 1 章 引言 研究显示，HCC 或 HCV 感染的病人外周血中 MDSC 的比例均显著升高。这群 MDSC 表型为 CD14+ HLA-DR-/low，依赖精氨酸酶抑制 T 细胞增殖，同时在体外 可诱导调节性 T 细胞的产生，阻碍 NK 细胞功能发挥。此外还有证据暗示 HCV 感染的肝细胞可诱导 PBMC 分化为 MDSC85。2013 年发表的一篇文章采用了多 种肝癌模型进行 MDSC 的相关研究。他们分别采用了 DEN 诱导和 Myc 转基因 的原位癌模型和皮下荷瘤的异位瘤模型，发现 DEN 和 Myc 诱导的模型 MDSC 只在肝癌晚期发生累积， 而皮下模型早期 MDSC 的数目就开始显著上升。 并且， 移植瘤模型中 MDSC 的抑制能力比 DEN 肝癌模型中的强 68。 采用多因子抑制剂 sorefanib 和抗 CD137 抗体的治疗可显著下调肝脏中 MDSC 的比例。 HCC 发展过程中一些可溶性因子参与了 MDSC 的募集，包括肿瘤细胞来源 的 GM-CSF 和 CXCL1， IL-17。 T 细胞分泌的 IL-17 促进肿瘤细胞分泌 CXCL5， 从而与 MDSC 上的受体 CXCR2 结合来募集 MDSC，并能直接增强 MDSC 的抑 制作用。反过来，MDSC 释放的 IL-1 和 IL-23 可促进 T 细胞分泌更多的 IL- 17，形成正反馈链。DEN 引起的 HCC 模型中，IL-18 同样可影响肝脏 MDSC 的 比例 66, 82。 有趣的是， MDSC 也参与肿瘤的肝转移。 在腹腔内的不同肿瘤模型中， MDSC 均能累积在肝脏，且与脾脏中的 MDSC 不同，这些细胞免疫调节因子的表达水 平更高，亚型主要表现为 M-MDSC86。这也许能解释为什么腹腔内肿瘤倾向于发 生肝转移。 现有许多研究虽观察到肝脏中 MDSC 的累积现象，发现众多相关分子，却 并未对其中的具体机制深入研究。 此外， MDSC 的异质性也带来更多的重要问题 70， 包括 MDSC 的亚型在其中的分布规律， 是否存在相关亚型特异的关键分子， 亚型之间是否存在转换等重要问题。此外，肝脏特殊的区域化免疫环境会不会导 致 MDSC 功能与其他肿瘤和组织中的不一致等，这些问题都需深入研究。 1.3 CD146 与免疫系统 1.3.1 CD146 概述 CD146，最初作为人黑色素瘤发展和恶化的标志物分子被发现 87，先后被不 15 CD146 促肝炎-肝癌恶性转化的作用机制 同的发现者命名为 MUC18、Mel-CAM、MCAM、A32 抗原或 S-Endo-188-91。它 位于人第 11 号染色体长臂的单拷贝基因，由 16 个外显子组成，长约 14kb。其 翻译产物是由 646 个氨基酸残基组成的单次跨膜型膜蛋白， 隶属于免疫球蛋白 超家族(IgSF)成员，与 B-CAM、ALCAM 和 KG-CAM 等胞粘附分子高度同源。 CD146 分子量大小约为 113kD，氨基酸序列包含一个信号肽，胞外 V-V-C2-C2- C2 五个类免疫球蛋白结构域，一个跨膜区和一个短的胞内尾巴。每个免疫球蛋 白结构域包含至少一对二硫键，以维持其结构上的稳定。胞内区由 63 个氨基酸 组成，但有多个可能的蛋白激酶识别位点及与其它蛋白相互作用位点，暗示 CD146 可能参与信号传导过程 88, 92, 93。小鼠中存在两种 CD146 的亚型，分别为 长亚型（long isoform）和短亚型 94（short isoform） 。这两种亚型胞外区序列相 同，因此具有相似的细胞粘附能力。但胞内段序列上具有较大差异，因此推测两 种亚型向下游传导不同的信号通路。此外，与许多其它的细胞粘附分子一样， CD146 除了以跨膜蛋白的形式存在外， 还存在通过剪切产生的可溶形式， 称为可 溶性 CD14695（soluble CD146, sCD146） 。 1.3.2 CD146 与免疫密切相关 近年来，多项研究显示 CD146 与炎症密切相关。20 世纪初，科学家们发现 CD146 参与不同疾病的发生，包括风湿性关节炎 96、慢性阻塞性肺部疾病97、二 型糖尿病并发的慢性血管炎症 98。此外 Weninger 等发现炎性皮肤病中角质形成 细胞上调表达 CD14699以及 Daniel 等在慢性肾衰病人中亦发现了 CD146 的上调 100。2006 年及 2008 年，Bardin 及 Tsiolakidou 等均报道了炎性肠病（IBD）病人 肠道血管 CD146 表达的上调 101, 102。这些结果都暗示 CD146 以某种方式参与炎 症的发生发展， 然而以上研究都仅局限于组织表达水平的分析， 没有讨论 CD146 参与炎症反应的具体机制。2014 年，本实验室通过 CD146 敲除小鼠和抗 CD146 抗体干预实验发现肠炎微环境中 TNF- 可通过 NF-B 信号上调小肠内皮上 CD146 表达，从而促进炎症细胞浸润，加快肠炎相关癌症的发生 103。实验室前 期还发现，CD146 与自身免疫性疾病密切相关。在 MS（多发性硬化）中，血脑 屏障内皮细胞上 CD146 可通过促进炎症性淋巴细胞向中枢的迁移促进疾病 的发展 104。 16 第 1 章 引言 另有一些研究还发现 CD146 在免疫细胞上有表达。1997 年 Pickl 等发现用 植物凝集素（PHA）体外刺激 T 细胞后能上调表达 CD146，并从风湿性关节炎 患者的滑膜液中分离到 CD146 阳性的 T 淋巴细胞， 因此认为 CD146 可作为某些 T 细胞亚群的激活标记 105。2007 年，Elshal 等的研究发现 CD146 在健康人外周 血淋巴细胞中的一小部分亚群上有表达，并在被有丝分裂原和 IL-2 刺激后表达 有所上调 106。随后，Guezguez 等研究发现，CD146 在 NK 细胞上的表达能促进 NK 细胞伪足或者微绒毛的产生，进而增强其在内皮细胞的粘附和滚动；而转染 了 CD146 的 NK 细胞和 CD4 阳性的 T 细胞能与 CD146 蛋白发生相互作用。他 们认为 CD146 可能通过同型相互作用促进淋巴细胞与内皮细胞的粘附和滚动， 进而有利于淋巴细胞在炎症部位的募集 107。但 Bardin 等在单核细胞的研究则提 出 CD146 通过异形相互作用促进白细胞与内皮细胞的粘附和穿越 108。 2008 年法 国科学家Frdric Vly 实验室发现，CD146 是小鼠自然杀伤细胞成熟的标志分子， 并且抗体刺激活化后，相较于不表达 CD146 的 NK 细胞，CD146 阳性的 NK 分 泌 IFN-的量更少，细胞毒性作用更弱 109，提示 CD146 的表达可能影响 NK 细 胞功能。2012 年，Flanagan 等报道 Laminin-411 是淋巴细胞上 CD146 的配体， 可介导淋巴细胞穿越内皮 110。 但白细胞上 CD146 与血管内皮 CD146 是否存在同 型相互作用，亦或两种 CD146 是否各有不同的配体，仍需要后续的研究给出更 多的实验证据。 此外，CD146 参与免疫反应的另一个证据是它在胸腺中表达。 早期研究通过免疫组化和免疫电镜技术， 发现在胸腺中除毛细血管以及血管平滑 肌表达 CD146 外，未成熟胸腺细胞、巨噬细胞也表达 CD146 分子 111。但其表达 的意义与功能尚不清楚。 实验室近几年在 CD146 与炎症方面取得了新进展。Duan H 等发现在 AS（动脉粥样硬化）中，巨噬细胞上 CD146 可被氧化型低密度脂蛋 白(ox-LDL)诱导上调，而且对巨噬细胞中 ox-LDL 诱导的 NF-B 信号途径的活 化很重要。 之后通过进一步功能实验发现， CD146 是巨噬细胞吞噬脂质分化为泡 沫样巨噬细胞过程所必需，靶向巨噬细胞 CD146 可以诱导泡沫样巨噬细胞向斑 块外的迁移，延缓 AS 进展 112。 抗体对于分子的功能研究不可或缺。已发现的抗 CD146 的抗体主要有几种， 如法国 Sampol 实验室报道 CD146 的单抗 S-endo1 及 Solovey 等制备的单抗 P1H12 可结合人的各种类型的血管内皮细胞 113； 英国的 Kuz 和他的同事发现 17 CD146 促肝炎-肝癌恶性转化的作用机制 CD146 的另一株单抗 MUC18 只结合毛细血管和高内皮微静脉 114； 我们实验室制 备出的特异的 CD146 功能性抗体 AA98 却能结合新生血管内皮细胞， 并可通过 抑制血管新生进而抑制肿瘤的生长 115。 研究显示不同 CD146 的抗体与各种类型 的血管内皮组织有着不同的结合活性和生物功能。 我们推测这可能是由于不同的 CD146 抗体结合表位的差异，造成结合谱和功能上的区别。 除 AA98 外， 我们实 验室还鉴定出另外几株抗体， 分别命名为 AA1，AA2，AA3，AA4，AA5 和 AA7， 均为 IgG1、 k 型 116。 其中 AA1 和 AA2 识别天然状态下的 CD146， 而 AA3， AA4， AA5 和 AA7 则不能识别天然构象的 CD146。进一步的分析显示，AA1 和 AA2 识别天然构象中 CD146 胞外段的 Domain 1 结构域。而 AA3，AA4，AA5 和 AA7则识别 Domain 4结构域， 而且它们的识别表位在天然状态下是隐蔽的。 AA98 则识别天然构象中 Domain4 和 5 之间二硫键形成的构象表位，这对于 AA98 发挥 其功能具有关键的作用。 1.3.3 CD146 与肝脏疾病 肝脏，作为人体重要器官，病变之后极易危害人体健康甚至生命。现在慢性 肝病的诊断和治疗并没有确切的指标和特效的药物， 因此成为全球排名前三的疾 病杀手。 科学家们希望通过基础机制研究找到肝脏特异有效的靶点来为治疗提供 新策略。 CD146 作为肿瘤新生血管内皮分子， 在肝窦内皮细胞上也有表达， 并被作为 血管内皮的标志分子 117, 118。2015 年与 2016 年分别有报道将 CD146 作为肝癌检 测和治疗的靶标，暗示 CD146 作为靶标的潜能 119, 120。2016 年，Wang Xuehao 利 用肝癌病人组织与肝癌细胞系研究发现， CD146 在肝癌组织中明显上调， 其高表 达可促进肝癌细胞转移，与病人预后差和短的生存时间密切相关。体外细胞系实 验显示 CD146 可能通过 IL-18 与 STAT1 来参与疾病发展 121。这可能为本论文之 后的机制研究方向提供参考。2015 年，希腊科学家 Dourakis SP 检测了 27 例健 康人和 106 例不同程度肝病患者血清中 sCD146 的含量，包括 43 例非硬化慢性 肝病患者，35 例代偿失调性肝硬化和 27 例代偿性肝硬化患者。结果显示（图 1.3.3） ，肝硬化患者血清 sCD146 水平明显高于非硬化肝病患者。而在硬化患者 中，代偿失调性硬化患者明显高于代偿性硬化病人，且 s