抗肿瘤抗体及其靶分子的研究

分类号分类号 Q93 Q93 密级密级 UDC 579 579 编号编号 中国科学院研究生院中国科学院研究生院 博士学位论文博士学位论文 抗肿瘤抗体及其靶分子的研究抗肿瘤抗体及其靶分子的研究 林林 芸芸 指导教师指导教师 阎阎 锡锡 蕴蕴 研究员研究员 博士博士 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 申请学位级别申请学位级别 博士博士 学科专业名称学科专业名称 微生物学微生物学 论文提交日期论文提交日期 20042004 年年 9 9 月月 日日 论文答辩日期论文答辩日期 20042004 年年 9 9 月月 日日 培养单位培养单位 中国科学院微生物研究所中国科学院微生物研究所 学位授予单位学位授予单位 中国科学院研究生院中国科学院研究生院 答辩委员会主席答辩委员会主席 林芸博士学位论文 2004 摘要 I 摘 要 粘附分子 CD146 在黑色素瘤的发生、转移过程中十分重要。本实验室发现了 CD146 分子在肿瘤血管生成中的新功能。第一部分实验以 CD146 特异性单克隆抗 体 AA98 为工具研究了 CD146 在血管内皮细胞上的功能，发现：1. CD146 分子 参与血管内皮细胞的增殖、迁移，介导肿瘤细胞与血管内皮的粘附，AA98 的加 入可阻断上述过程；2. CD146 参与的信号传导途径证明在内皮细胞和黑色素瘤 细胞上，CD146 的活化能导致胞内钙库的释放与胞外钙离子内流，说明 CD146 诱 发的信号通路能影响细胞骨架的重排， 这可能是 AA98 抑制肿瘤血管生成的原因。 3. 与以往报道不同的是， 发现内皮细胞同时表达 CD146 配体并介导内皮与 CD146 阳性黑色素瘤细胞A375的粘附， CD146与其未知天然配体的相互作用能被AA98 部分阻断。以上结果显示 CD146 与其天然配体的结合在血管内皮细胞的增殖、迁 移、信号转导、粘附等血管生成相关过程中发挥重要作用，也是理想的肿瘤血管 生成治疗新靶点。在上述研究的基础上，发现 CD146 分子有进一步应用至肿瘤 主动免疫治疗的潜力。对 CD146 特异性抗体 AA98 进行改造，其阿霉素偶联物很 好的体现了靶向血管的化疗药物特征，基因工程抗体片断 VH/L 也保持了抗体结 合活性和抗血管生成活性，都是值得继续研究开发的肿瘤诊断、治疗制剂。 第二部分工作对于一株单克隆抗体 T22 的抗肝癌活性进行了鉴定， 发现其 在裸鼠肝癌模型中能显著抑制肿瘤的生长，同时在体外抑制肝癌细胞 SMMC 7721 的生长、迁移和对胞外基质蛋白 laminin 的粘附。流式分析与细胞免疫荧光结果 提示 T22 的抗原是骨架相关蛋白，并且与细胞角蛋白的分布类似。由于目前对 肝癌的治疗尚缺乏有效手段， 该抗体及其抗原有望成为新的抗肝癌制剂以及肿瘤 标志分子。 第三部分工作利用超高分辨率扫描电镜观察了 SARS 冠状病毒的表面形态， 首次报道其精细三维结构与病毒颗粒表面 S 蛋白的三聚体结构。 与基因分析所得 到的病毒表面蛋白结构相互映证，丰富了该病毒的形态学信息，并为 SARS 防治 策略的设计提供有益的启示。 关键词：CD146，肿瘤血管生成，抗体，肝癌（HCC） ，SARS 冠状病毒（SARS-CoV） 抗肿瘤抗体及其靶分子研究 II Anti-tumor antibodies and their antigens Yun Lin (Microbiology) Directed by Xiyun Yan Abstract Adhesion molecule CD146 plays a key role in melanoma growth and progression. We discovered that CD146 also involved in tumor angiogenesis. First part of the theses focus on studying the function of CD146 on vascular endothelial cell by using its specific monoclonal antibody AA98. The results are outlined in several points: 1.CD146 plays a role in the proliferation, migration of endothelial cell and mediates adhesion of tumor cells with vascular endothelium, which can be blocked by AA98. 2. Activation of CD146 triggers the release of intracellular calcium pool and extracellular calcium influx, both on endothelial cells and melanoma cells, suggesting the effect of CD146 on rearrangement of cytoskeleton and implies the possible reason for AA98 inhibition on tumor angiogenesis. 3. Differ from the former claim that endothelial cells dont express CD146 ligand, we found CD146 and its natural ligand both expressed on endothelial cells. The adhesion of CD146 positive A375 cells to endothelial cells is mainly mediated by binding to the ligand on endothelial cells and can be partly blocked by AA98, which indicates that interaction of CD146 and its unknown ligand is important in angiogenesis-related processes such as proliferation , migration, signaling and adhesion of endothelial cells. CD146 may be a novel potent candidate for angiogenesis based cancer therapy We further found the CD146 a promising target for active tumor immunotherapy. Modification to AA98 showed that the amycin conjugate well represented the effect when chemotherapeutic agents are utilized to target tumor vasculature. The three domain antibody fragment VH/L retains binding specificity and anti-angiogenic property, deserving further study to develop as new agents for tumor diagnosis and therapy. The second part studied the anti-hepatoma activity of a monoclonal antibody T2-2 and found it effective in significantly inhibiting tumor growth in hepatoma xenografts on nude mice. T2-2 is also an inhibitor in 林芸博士学位论文 2004 摘要 III vitro for the growth, migration and adhesion to ECM component lamin of hapatocellulalr carcinoma cell line SMMC 7721. FACS analysis and immunofluoresence assay displayed the similarity of T2-2 antigen distribution with cytoskeleton protein such as cytokeratin. As we still lack efficient way treating hepatom, antibody T2-2 and its antigen have the potential to be developed as novel anti-hepatoma agent and marker. In the last part, we observed the SARS-CoV surface using ultra high-resolution scanning microscopy and first reported the fine dimensional structure of virion surface and the trimerization of S protein, the constituent of spikes, which proved the deduction from sequence analysis. The findings enriched the morphological information of SARS-CoV and suggested potent strategy for SARS prevention and treatment. Key words: CD146, tumor angiogenesis, antibody, human hepatocellular carcinoma (HCC), SARS-CoV 抗肿瘤抗体及其靶分子的研究 IV 缩 写 表 Ab 抗体(antibody) ADM 阿霉素(Adriamycin) aFGF 酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor) Ag 抗原(antigen) Ang 促血管生成素（Angiopoietin） Amp 氨苄青霉素(ampicillin) AP 碱性磷酸酶(Alkaline Phosphotase) APES 3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltoxysilane) BCIP 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate) bFGF 碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor） bp 碱基对(base pair) BSA 牛血清白蛋白(bovine serum albumin) CAM 鸡胚尿囊膜（chicken chorioallantoic membrane） CDI 软骨衍生抑制因子（Cartilage-derived inhibitor） cDNA 互补 DNA( complementary DNA) CFA 完全弗氏佐剂（complete Freunds Adjuvant） DAB 二氨基联苯胺(diaminobenzidine) DMEM Dulbecco 改进的 Eagle 培养基 (Dulbecco modified Eagles medium) DMSO 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide） dNTP 四种脱氧核糖核苷酸(four deoxyribonucleotides) DTT 二硫苏糖醇(dithiothreitol) EC 内皮细胞（endothelial cell） ECM 细胞外基质（extracellular matrix） EDTA 乙二氨四乙酸( ethylene diamine tetraacetate) EGF 表皮生长因子（epidermal growth factor） ELISA 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay) Fab 抗原结合段（antigen-binding fragment） FACS 流式细胞术（fluorescence-activated cell sorting） FCS 胎牛血清（fetal calf serum） Flk-1 胎肝激酶-1（fetal liver kinase-1） Flt-1 fms 型酪氨酸激酶-1（fms-like tyrosine kinase-1） Fv 可变区片断(variable domain fragment) G-CSF 粒细胞集落刺激因子（Granulocyte colony stimulating factor） GM-CSF 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor） H 重链(heavy chain) HCG 人绒毛膜促性腺激素（Human chorioic gonadotropin） HGF 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor） HRP 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase) HUVEC 人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell) ICFA 不完全弗氏佐剂（incomplete Freunds Adjuvant） Ig 免疫球蛋白(immunoglobulin) 林芸博士学位论文 2004 缩写表 V IGF 胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor） IFN 干扰素（interferon） IL 白细胞介素(interleukin) IP-10 干扰素诱导蛋白 10（interferon-inducible protein 10） IPTG 异丙基-D-硫代半乳糖甘(isopropyl-D- thiogalactopyranoside) Kan(Km) 卡那霉素(kanamycin) kb 千碱基对(kilo base) kDa 千道尔顿(kilodalton) L 轻链(ligth chain) MAb 单克隆抗体(monoclonal antibody) mIgG 小鼠免疫球蛋白 MMP 基质金属蛋白水解酶（matrix metalloproteinase） MTT 四甲基偶氮唑盐（Methyl Thiazolyl Tetrazolium） NC 硝酸纤维素（nitrocellulose） NBT 氯化硝基四氮唑蓝（Nitro Blue Tetrazolium Chloride） -ME -巯基乙醇(-mercaptoethanol) O.D. 光密度(optical density) PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis) PAI-1 纤溶酶原激活抑制物（plasminogen activatior inhibitor type 1） PBS 磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline) PCR 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) PD-ECGF 血小板衍生内皮生长因子（platelet derived endothelial cell growth factor） PDGF 血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor） PECAM 血小板内皮细胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule） PEDF 色素上皮衍生因子（Pigment-epithelium derived factor） PEG 聚乙二醇(polyethylene) PF-4 血小板因子-4（platelet factor-4） PIGF 胎盘生长因子（placenta growth factor） PPARg 辣 根 过 氧 化 物 酶 体 增 殖 因 子 激 活 的 g- 型 受 体 (Peroxisome Proliferator-activated receptor gamma agent) PRP 增生相关蛋白（proliferin-related protein） RBS 核糖体结合位点（ribosome binding site） rpm 每分钟转数(rounds per minute) RT-PCR 反转录 PCR(reverse transcription PCR) ScFv 单链抗体(single-chain fragment variable) SDS 十二烷基硫酸钠(sodium dedecyl sulfate) TIMP 组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase) TGF 转化生长因子（transforming growth factor） TNF 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor） tPA 组织纤溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator） Tris 三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane） 抗肿瘤抗体及其靶分子的研究 VI TSP 血小板反应蛋白-1（Thrombospondin-1） uPA 尿激酶性纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator) VEGF 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor） VEGI 血管内皮生长抑制因子（vascular endothelial growth inhibitors） VH 重链可变区(heavy chain variable region) VL 轻链可变区(light chain variable region) 林芸博士学位论文 2004 目录 VII 目目 录录 中文摘要I 英文摘要II 缩写表缩写表IV 目录VII 文献综述1 第一部分 肿瘤血管生成及靶向治疗 1 1肿瘤血管生成 1 2抗血管生成治疗策略 6 3粘附分子 CD146 14 第二部分 治疗性抗体研究历程及发展趋势 17 研究工作22 材料与方法22 实验结果与讨论33 第一部分 粘附分子 CD146 在肿瘤血管生成中的作用33 1. CD146 分子在血管内皮细胞上的表达与功能 33 2. CD146 分子作为疫苗对小鼠肿瘤模型的保护性作用 42 3. AA98 阿霉素偶联物对肿瘤细胞的杀伤作用 43 4. AA98 基因工程抗体 VH/L 的表达及活性鉴定45 第二部分: 单克隆抗体 T2-2 对人肝癌细胞系的作用 48 1. 单克隆抗体 T2-2 抗原识别肝癌组织和细胞系 SMMC 772149 2. 抗体 T2-2 对 SMMC 7721 细胞的作用50 3. T2-2 抑制裸鼠 SMMC 7721 肝癌模型中肿瘤的生长 51 4. 细胞免疫荧光比较 T2-2 抗原与细胞角蛋白在 SMMC 7721 细胞的分 布 第三部分 SARS-CoV 的表面形态学研究 参考文献 发表文章 致谢 林芸博士学位论文 2004 文献综述 1 文 献 综 述 第一部分 肿瘤血管生成及靶向治疗 哺乳动物细胞的生长需要氧气和营养， 因此要求细胞周围 100200m 的范 围内有血管存在，因为该范围是氧扩散的最远限度。对于多细胞生物而言，如果 体积超过此限度，就必须通过两种形式“血管建成”或“血管生成”产生新 血管（图 1） 。血管建成是指胚胎期中胚层来源的血管母细胞（未形成管腔结构 的内皮细胞）分化形成原初血管网（1） 。血管生成则是通过出芽或分裂方式从已 有的血管丛形成新血管的过程（2） ，见于多种生理、病理反应，是原有血管网的 重塑。该过程由多种正负调节因子的动态平衡严谨调控，在许多疾病，尤其是肿 瘤发生中会表现出异常。 早在 100 年前就已观察到肿瘤周围的血管生成现象 （3-5） 。 1968 有假说认为 肿瘤产生可扩散的“血管生成”物质（6，7） 。1971 年，Folkman 提出肿瘤的生 长和转移依赖于血管生成，如果封闭该过程将有助于遏制肿瘤生长（8） 。该理论 催生了大量关于肿瘤血管发生机制、血管生成调节分子的研究，以及新型抗肿瘤 药物的研发和抗肿瘤血管生成疗法的产生（9） 。 和传统的治疗手段相比，抗血管生成药物在治疗肿瘤方面显示出许多优越 性，如渗透性好、不易引起耐药性、广谱性等。由于血管生成在成人正常生理过 程中发生频率很低，只出现于伤口愈合、感染、排卵、妊娠和局部缺血过程，所 以发展针对血管生成的特异性治疗能很好的避免毒副反应。 近年来抗血管生成治 疗肿瘤已取得了较大进展，多种药物进入临床试验。今年二月，重组的人源化抗 VEGF 单克隆抗体 Avastin 被美国食品及药物管理局（FDA）批准为抗肿瘤血管 生成药物，这是迄今第一个进入市场的抗肿瘤血管生成生物制剂。 随着分子遗传学的发展我们可以更深入认识肿瘤血管生成的生理、病理机 制，揭示正常和异常状态的血管在血管生成中的功能，以及此过程中所涉及的关 键分子，从而针对性的发展相应治疗策略。 1. 肿瘤血管生成肿瘤血管生成 1.1 血管生成与肿瘤血管形态学血管生成与肿瘤血管形态学 血管生成有两种不同的形式：1. 出芽。从原有的血管基础上芽式生长成毛 细血管，其内皮朝着产生血管生成因子的细胞，在血管芽的顶端生长延长，包括 细胞外基质的降解、内皮细胞趋化性迁移和增生、内皮板层的形成和功能成熟， 见于胚胎发育和晚期器官形成过程如脑的发育（2） 。2. 分裂。内皮细胞增殖致 使管腔增大，通过产生贯穿毛细血管的间隙组织柱而最终导致血管腔裂开，也称 套叠式生长。主要见于心脏和肺发育（10） 。 正常器官和组织的血管处于静息的状态， 这是因为血管生成的正负调控系统 抗肿瘤抗体及其靶分子研究 2 处于平衡之中。在女性月经周期、妊娠期、伤口愈合等情况下，会开启生理性的 血管生成一段时间后迅速关闭。 而病理性的血管生成如肿瘤血管生成中正负调控 系统失衡，从而导致持续、无控的血管生成。迅速生长的肿瘤血管表现出一系列 结构异常：高度无序、血管扭曲、内皮不完整、基底膜不连续甚至缺失、血流紊 乱不稳定（11） ，易导致肿瘤内出现缺氧和酸性区（12） ，不仅降低了抗肿瘤药物 的效力，还不断调节血管生成因子的产生，有利于高恶性和转移性肿瘤细胞的选 择（13） 。由于血管通透性高（14-16） ，缺乏功能性的淋巴系统（17） ，造成新生 毛细血管间质高压，不仅进一步抑制淋巴官形成（18） ，还干扰抗肿瘤药物的运 送（19） ，同时促进肿瘤细胞的扩散和转移（20） 。 图 1.血管生成与血管建成 1.2 肿瘤血管生成的机制肿瘤血管生成的机制 对肿瘤血管生成机制的研究已经越来越深入， 目前至少有四种假说解释肿瘤 诱发血管生成的机制。第一种是由 Judah Folkman 在三十年前提出的，认为肿瘤 在无血管状态下只能生长到 12mm3，也无法转移至其它器官。若要持续生长， 必须诱发新的血管。 该过程中肿瘤可能分泌血管生成生长因子刺激内皮细胞的酪 氨酸激酶活性，如分泌血管内皮生长因子（VEGF）和其它生长因子（21）促进 血管生成。第二种假说提出肿瘤能够在已有血管基础上增加血管。肿瘤在血管周 围生长，通过上调 Ang2 使基质结构疏松，破坏血管刚性，导致肿瘤中心坏死缺 氧，进而刺激 VEGF 表达和肿瘤周围的血管生成（22-25） 。第三种假说则认为血 管生成的调节可能部分来自循环造血前体的作用（26-29） 。在肿瘤和伤口血管生 成区域发现存在 CD34 阳性的循环内皮细胞前体（30-32） 。在小鼠基因敲除模型 上的实验表明循环的血管内皮前体细胞有助于血管生成， 但是究竟在成人体内起 林芸博士学位论文 2004 文献综述 3 多大作用，该机制是否为肿瘤血管生成所必需，还有待更深入的研究（33） 。第 四种是由 Hendrix 等提出的“血管模拟” （34-38） 。许多证据显示肿瘤血管与正常 血管内皮相比存在差异，如与孔径相关的血管渗透性。用各种染料对血管进行染 色发现肿瘤血管的渗漏性要高于正常血管。Hendrix 等发现在某些肿瘤，尤其在 血管膜黑色素瘤中，肿瘤细胞能形成血管样结构并行使血管功能。但是这一假说 存在很大争议。McDonald 等报道肿瘤血管壁并不完全由同源性的内皮细胞层构 成，而是内皮细胞与肿瘤细胞、内皮细胞形成的镶嵌体组成。在自发形成或接种 的结肠癌组织中有 15的血管是镶嵌形式，3 的内皮为肿瘤细胞占据（39） 。 关于此现象形成的原因究竟是癌细胞外渗至血管腔的瞬时体现， 还是模拟内皮细 胞行为， 或者是内皮细胞凋亡暴露出肿瘤细胞导致， 还没有定论。 无论哪种机制， 肿瘤血管上存在癌细胞的现象对于肿瘤转移和抗血管生成治疗都具有极其重要 的意义。 目前广为接受的是在第一种机制基础上由Hanahan 和 Folkman在1996年提 出的“血管生成转换（angiogenic switch） ” ，该假说认为内皮细胞增殖形成新血 管的过程中发生“转换” 。决定“转换”开启的因素是血管生成抑制因子和激活 因子的水平。当正负调节因子处于平衡时 “关闭” ，平衡被打破而倾向于促血管 生成方向时“打开” （40，41） 。多种内皮细胞、基质细胞和胞外基质分泌的内源 性促/抑血管生成因子（42）已经得到鉴定（表 1） 。此外“血管生成转换”还受 到多种信号的触发，包括代谢压（如低 pH，缺氧，低血糖） 、机械压迫（如细胞 增殖产生的压力） 、免疫/炎症反应（如免疫/炎症细胞浸润）和遗传突变（控制血 管生成调节因子表达的原癌基因的激活和抑癌基因缺失） （43，44） 。环境与遗传 机制的共同作用如何影响肿瘤的生长和血管生成是一个非常复杂的过程， 还有大 量未知细节有待揭示。 Folkman 实验室研究血管生成的细胞学基础发现肿瘤细胞在最初是“非血管 生成型”（non-angiogenic）的，只有一部分肿瘤细胞转变为 “血管生成型” （angiogenic）为整个肿瘤提供足够的血管（45，46） 。在多种人、动物肿瘤中都 发现，一旦发生血管化，肿瘤内含有两群细胞，它们均可进入循环，但是非血管 生成型的细胞形成静止性微转移灶，血管生成型的则能快速生长转移。在血管化 的肿瘤内部这两群细胞同时存在，这可能是人肿瘤移植到 SCID 小鼠的时候常常 失败的原因之一。 当用 ras 癌基因或 VEGF 基因转染非血管生成型的肿瘤细胞后， 细胞可以转变为血管生成型并快速生长。 很小比例的血管生成型细胞就能满足肿 瘤血管化和生长的需要。 1.3 1.3 肿瘤血管生成的调节肿瘤血管生成的调节 1.3.1 促血管生成因子与抗血管生成因子促血管生成因子与抗血管生成因子 调节因子的鉴定是理解血管生成机制的基础， 有助于对该过程的人为调控并 最终发展出可行的肿瘤治疗策略（47，48） 。血管生成调节因子由内皮细胞、肿 抗肿瘤抗体及其靶分子研究 4 瘤细胞和基质细胞分泌。表 1 总结了参与血管生成的分子。 表表 1 血管生成调节因子血管生成调节因子 Proangiogenic factors Antiangiogenic factors 1-Butyryl glycerol Laminin 2-Methoxy-estradiol IP-10 Adenosine Leptin 1,2,5-Dihydroxyvitamin D3 IL-1,4,12 Angiogenin Midkine Angiopoietin-2 Maspin Ang1 Nicotinamide Angiostatin Ligands of PPARg Collagen Perlecan Antiangiogenic antithrombin III PEGF Del-1 Phospholipids Calreticulin Placental ribonuclease inhibitor Entactin PIGF Canstatin Plasminogen fragment Kringle 5 EGF PDGF CDI PF4 Ephrins Pleiotropin CD59 complement fragment Prolactin 16 kda fragment aFGF and bFGF Proliferin Decorin PRP Fibronectin Prostaglandins E1 and E2 Endostatin Retinoids Follistatin Scatter factor (SF) Fibronectin fragment Soluble VEGF receptor G-CSF TFG and TFG- Gro-b Tetrahydrocortisol-S Heparin/heparan sulfate TNF- Heparinases TSP-1, 2 HGF VEGF Heparin hexasaccharide fragment TIMP-1,2, 3 IL-8 hCG Vasculostatin IFNa, b, g Vasostatin 目前已知的激活内皮细胞生长和迁移的促血管生成因子主要有 angiogenin、 血管内皮细胞生长因子（VEGF） 、胎盘生长因子（PIGF） 、酸性及碱性成纤维细 胞生长因子 （aFGF， bFGF） 、 表皮生长因子 （EGF） 、 estrogen、 白介素 8、 prostaglandin E1, E2、肿瘤坏死因子 （TNF-） 、GM-CSF。此外还有很多转录因子和 Notch 家族成员也为新血管形成所必需。 在所有的血管生成因子中，对 VEGF 及 bFGF 的研究最为深入。VEGF 具有 增加微血管的通透性、促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管构建、促使内皮 细胞的迁移等多种作用，是已知最强的血管通透剂。VEGF 选择性地作用于血管 内皮细胞膜上的两种 III 型酪氨酸激酶受体 flt-1 和 KDR， 通过磷酸肌醇特异性磷 酯酶 C 使胞内甘油三酯（IP3）浓度升高而发挥作用（49-51） 。bFGF 是一种重要 的促血管生成因子，它由肿瘤细胞、巨噬细胞或胞外基质释放，能够上调某些重 要的促血管生成因子如 VEGF 和纤溶酶原激活物，并通过 Bcl-2 途径抑制内皮细 胞的凋亡。 bFGF 主要通过与其高亲和性受体 bFGFR 的结合发挥生物活性 （52） 。 Angiopoietin（Ang）是生长中的血管周围细胞产生的一族蛋白分子，包括 Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4。Ang1 作用于内皮特异的 Tie-2 受体，维持成熟 血管的完整性及静息状态，并参与生理及病理情况下如月经周期、伤口愈合等的 血管新生。近年发现，Ang-2 的功能与 Ang-1 相拮抗，它可阻止 Ang-1 与 tie-2 的结合。Ang-1 与其受体可能刺激生长因子的产生，继而促进周围间质分化形成 林芸博士学位论文 2004 文献综述 5 周细胞（pericyte）或平滑肌细胞共同构成血管壁，维持血管的稳定（53）。Ang-2 表达是肿瘤血管生成起始过程中作用显著，与肿瘤血管形成数目、临床分期、预 后密切相关（54，55）。 只有血管生成的存在还不足以启动新血管的生长。 促血管生成因子的作用必 须通过抑制因子的动态平衡实现。静止状态的肿瘤分泌的抑制因子主要有 endostatin、angiostatin、血小板反应蛋白（thrombospondin, TSP）和金属蛋白酶 组织印制因子（TIMP） （56） 。已有报道不同的血管生成抑制因子如 TSP-1、 angiostatin、endostatin 均可诱导培养内皮细胞的凋亡（57-60） 。TSP-1 还引起内 皮细胞凋亡、抑制与 Bax 过表达相关的血管生成、降低 Bcl-2 表达，还能在体外 减弱内皮细胞上 VEGF 介导的 Bcl-2 表达，抑制体内血管生成（60） 。 1.3.2 粘附分子与粘附分子与细胞外基质（细胞外基质（extracellular matrix, ECM） 内皮细胞之间表达特异的粘附分子及受体介导细胞间连接，包括内皮细胞粘 附分子(PECAM-1 或称 CD31)、 血管内皮钙粘素(VE-cadherin) （61） 、 CD 146 （62） 。 当血管成熟后， 依赖不同血管床而形成更多的连接复合体如紧密连接、 缝隙连接。 因而在血管发展中，初期主要是细胞间的识别、粘附，然后才形成连接复合体， 但具体的调节尚未阐明。 ECM 和基质粘附受体在血管发生和发展中也起着重要作用：内皮细胞表面 存在介导细胞-细胞外基质的蛋白和蛋白聚糖，如整合素家族，它具有粘附和信 号传导功能。其中v3在肿瘤血管特异性高表达（63-66） ，在肿瘤血管生成中发 挥重要作用，而v3参与 VEGF 诱发的血管生成（67，68） 内皮细胞在 ECM 上的运动严格受控，它先需要整合素介导的细胞-基质间 的粘附复合体的形成、解聚，细胞骨架组分的复位与基质的降解过程的循环，除 整合素及配体外，基质金属蛋白酶（MMP）、纤溶酶原激活物与它们的底物以 及抑制因子参与该过程的调节。当内皮细胞接受血管生成因子的刺激，其产生的 蛋白酶、胶原酶等使局部基底膜降解，为细胞的移出开辟通道（69）。 综合调节因子、粘附分子、胞外基质、肿瘤及内皮细胞的研究结果，可勾勒 出肿瘤血管生成的大致过程：非生长状态的成熟毛细血管壁由内皮细胞、基底膜 和一层部分包围内皮的外周细胞组成。 肿瘤细胞产生的血管生成因子和内皮细胞 上的受体结合启动血管生成。当内皮细胞受到刺激后开始增殖，分泌蛋白酶、肝 素酶等降解血管周围的基底膜。 肿瘤细胞和其它支持细胞分泌的金属内肽酶 基质金属蛋白酶（MMP）家族成员在降解已有血管的基底膜和胞外基质过程中 起首要作用。胞外基质的降解导致促血管生成因子的释放（70） 。内皮细胞连接 也发生变化，新形成的血管“芽”向刺激因子趋化。内皮细胞侵袭基质并增生迁 移至肿瘤内部，形成管腔结构和新的基底膜。管腔形成过程为细胞表面分子和 ECM 的相互作用驱动。很多情况如代谢和机械压力、缺氧、遗传突变、原癌基 因或抑癌基因的表达变化， 都可能打破促血管生成因子和抑制因子的平衡从而刺 抗肿瘤抗体及其靶分子研究 6 激血管生长，但是具体的机制还不完全清楚（43，44） 。 1.4 血管生成与肿瘤转移血管生成与肿瘤转移 肿瘤转移是一个多步骤多分子参与的癌细胞宿主细胞相互作用的复杂连 续过程，在两个阶段依赖血管生成：1. 原发肿瘤血管化之前，肿瘤细胞一般不 脱落。原发肿瘤的血管组织越丰富，肿瘤细胞转移几率越大。新生肿瘤血管基底 膜不完整，血管通透性高，有利于肿瘤细胞的血行转移（71，72） 。2. 转移的癌 细胞到达目的器官后必须重新诱发血管生成过程， 否则只能在其渗出循环系统的 微血管周围形成显微水平的血管前期袖状结构. 处于细胞增殖和凋亡平衡的静 息状态，可持续数年。转移瘤血管生成同样决定于循环中血管生长正负调节因子 相对比例，且与原发瘤间存在相互调节作用. 原发肿瘤的切除往往导致转移瘤迅 速增殖，可能是由于循环中血管生长刺激因子的半衰期较短，只能聚集在原发灶 血管床内，但抑制因子的半衰期较长，在血液中的系统浓度高于刺激因子因而抑 制远端转移灶的血管生成.这种自身抑制转移瘤生长的现象不依赖任何特异的免 疫反应，被称作伴发性肿瘤抵御（concomitant tumor resistance） （73） 。这也是 angiostatin，endostatin，vasculostatin,，tumstain 发现的基础（74，75，76） 。 2. 血管生成靶向治疗血管生成靶向治疗 自 1971 年哈佛大学医学院的 Folkman 教授提出实体肿瘤的生长和转移依赖 于血管生成以来，许多研究者对这一理论进行了广泛深入的研究，形成了抗肿瘤 血管生成疗法（9，77） ，并取得较大进展。 抗肿瘤血管生成治疗通过抑制或破坏肿瘤血管生成切断肿瘤赖以生存的 “生 命线” ，达到“饿死肿瘤”的目的。与针对肿瘤细胞的传统肿瘤治疗相比，抗肿 瘤血管生成策略具有以下优势：1. 不易产生耐药性。因为肿瘤血管由遗传稳定 的二倍体内皮细胞组成， 即使多次反复给药甚至肿瘤复发再给药也不易产生耐药 性；2. 药物穿透性强，能直达肿瘤实体内部；3. 广谱性。由于各种肿瘤血管内 皮细胞具有相似性，抗血管生成药物能应用于多种肿瘤；4. 抑制肿瘤转移。因 为肿瘤转移过程也需要血管生成；5. 放大效应。有限数量的内皮细胞的破坏能 够引起肿瘤组织大范围的坏死和凋亡；6. 安全性。在正常成人，除伤口愈合和 生殖周期外，几乎素有的血管生成都是病理性的，如肿瘤、风湿性关节炎、银屑 病、视网膜病变等（73，78） 、抗血管生成药物引起的不良反应较小。因此以肿 瘤血管为靶的抗血管生成策略具有良好的发展前景。 2.1 内皮细胞靶点的发现内皮细胞靶点的发现 Angiomics 抗血管生成治疗的基础是鉴定内皮细胞生长、分化、凋亡过程的关键信号分 子和受体。目前寡核苷酸与 cDNA 微阵列筛选（microarray）及基因表达系列分 析（SAGE）等新技术被应用于寻找静息内皮和肿瘤内皮的基因表达差异（80） ， 林芸博士学位论文 2004 文献综述 7 以期获得内皮细胞的表达谱信息，有人称之为血管组（Angiomics） （81） 。高通 量分析技术的引入有助于鉴定肿瘤血管生成的新标志物， 为靶向药物的设计提供 信息。但是 microarray 不能提供潜在标志分子的功能信息，无法预知其中的某一 个或一些是否血管生成的关键基因, 也分析不出可能对血管生成重要的蛋白酶 解片断，如内源性血管生成抑制因子 angiostatin、endostatin、tumstatin 等。蛋白 质组分析手段的引入能弥补这一缺点。 蛋白微点阵分析灵敏度高 （可检测出细胞、 组织、或局部微解剖组织块中 1pg 蛋白的表达） 、可定量，还能反映蛋白表达情 况和磷酸化程度（82） 。利用 cDAN 文库或肽库从对抑制剂不敏感的内皮细胞中 钓取新分子的方法也可能会发现抑制或刺激血管生成的关键分子（83） 。此外筛 选生长因子或粘附分子（VEGF、ICAM-1、PECAM-1）的上调分子也是可考虑 的策略。 血管地址 正常血管在不同的器官也会存在差异（84） ，这些独特的“地址”或称“邮 编”可被用于发展靶向特定血管的药物。Arap 等（85）分析了噬菌体库在体内 对不同器官的结合情况，通过重复筛选出许多特异性定位于肿瘤的肽，如含有 RGD 和 NGF 的肽段（86） 。含 RGD 的肽结合于v3和v5整合素，含 NGR 肽 则与氨肽酶 N 结合。这两个分子都早已被证明对于血管生成非常重要，因为相 应的抗体或化学抑制剂均能在小鼠和鸡胚血管生成模型中产生抑制效应（64， 87） 。这种噬菌体体内筛选模式对于发展靶向肿瘤的放、化疗药物、生物毒素和 凝血因子都很有帮助。现在已经开始在病人体内寻找特异的血管地址（88） 。 2.2 抗血管生成治疗策略抗血管生成治疗策略 抗肿瘤血管研究主要从两个方面着手：一、增加血管抑制性调节因子，主要 通过重组蛋白或基因治疗的方式补充 angiostatin、endostatin、TIMP 等；二、减 少或抑制促血管生成调节因子，一方面通过多种单克隆抗体（如 VEGF 抗体 Avastin，bFGF 抗体 Ebitux，VEGFR-2 抗体 IMC-1C-11 等）封闭生长因子信号转 导；另一方面通过主动免疫诱导机体产生针对血管生