人源化抗CD146单克隆抗体的临床前转化研究——抗体中试规模标准化制备

博士学位论文博士学位论文 人源化抗人源化抗 CD146CD146 单克隆抗体的临床前单克隆抗体的临床前转化转化研究研究 抗体中试规模标准化制备抗体中试规模标准化制备 作者姓名：作者姓名： 王飞王飞 指导教师：指导教师： 阎锡蕴阎锡蕴 研究员研究员 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 学位类别：学位类别： 博士博士 学科专业：学科专业： 细胞生物学细胞生物学 研究所研究所： 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 二零一三二零一三年年五五月月 Pre-clinical research of an humanized anti-CD146 monoclonal antibodythe pilot scale downstream preparation of monoclonal antibodies By Fei Wang A Dissertation Submitted to University of Chinese Academy of Sciences In partial fulfillment of the requirement For the degree of Doctor of cellular biology Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences May, 2013 书脊书脊 人人 源源 化化 抗抗 C C D D 1 1 4 4 6 6 单单 克克 隆隆 抗抗 体体 的的 临临 床床 前前 转转 化化 研研 究究 王王 飞飞 中中 国国 科科 学学 院院 大大 学学 3cm 左右 3cm 左右 致 谢 I 致致 谢谢 时光荏苒，五年的研究生岁月如白驹过隙，转眼即逝。回首这段充实、美 好的经历，我在这里最想感谢的，就是我的导师阎锡蕴研究员，本论文正是在 她精心规划和悉心指导下才得以完成的。 作为一个而立之年又迈入学堂的学子， 我也许比其他同学少了一丝兴奋和冲动，却多了一分沉静和体会。从进入实验 室，我就感受到了阎老师强大的人格魅力。她对工作的心思缜密，会经常使我 汗颜于忽略了这样那样的细节；她对学术的精益求精，使许多人都对每两周一 次的工作报告如临大考；而她对美好事物的追求向往，又使我们能领略到如昙 花开放这样稀有却就在身边的美景。正如她所崇尚的“三自经” ：自立、自信、 自在，她时刻向大家传递着一种积极向上的正能量。从阎老师身上，我才切实 体会到了享受科研这样的境界；也许正是这样的境界，使她不仅具有我所仰慕 的渊博知识，还拥有了时常令我惊叹的敏锐洞察和大局把握。衷心感谢阎老师， 开拓了我的思路和眼界，历练了我的能力和本领。阎老师将是我以后事业中的 标杆和榜样，时刻激励着我奋发向上。 同样值得铭记并感谢的，还有我们实验室这个团结、向上的集体。每位老 师、师兄、师姐、师弟、师妹都是那样的特色鲜明，而他们唯一的共性就是都 如此的优秀。我会牢牢记住这些名字：王玉春、冯静、杨东玲、梁敏敏、王兆 卿、卢迪、宋丽娜、叶中德、段德民、张德玺、郑继燕、董碧宇、闫西冲、段 红霞、罗永挺、邢澍、曾启群、王平、姜天霞、范克龙、凃滔、高倩、刘丹、 吴真真、晏荟文、陈佳楠、张建林，正是他们的扶持和关照，使我得以享受了 这五年丰满的求学时光，感谢他们。我想，我们将会成为一生的朋友。 在此，还要感谢 GE 公司的朱希灿工程师，在蛋白质制备技术上对我无私 的支持和帮助。感谢研究生处的刘勤瑞、熊勤等老师对我的关心和指导。感谢 所有帮助过我、关怀过我的人，感谢我所有的朋友们，他们是我生命中宝贵的 财富。 最后，我要感谢我的家人。感谢我的父亲王伯敖先生和我的母亲陶香芬女 士，感谢他们多年来的养育、教导和支持。特别是我的父亲，正是他从我幼年 起就不断灌输给我的，崇尚科学和理想主义的精神，支持我在科研的道路上上 下求索而不悔。感谢我的爱人关琦，感谢她对我的理解和支持，感谢她陪伴我 走过这些平凡而真实的日子。虽然我们的未来未必是坦途一片，但是我们会携 手并肩追求美好的明天。 王 飞 2013 年 5 月 摘 要 II 摘摘 要要 抗体药物以其靶向性强，比传统药物更加安全有效的特点，成为了近年来 发展最快，并被人们寄予了最多期望的一类新型治疗剂。但是，由于抗体下游 制备技术的限制，即使处于早期阶段的抗体药物开发者，也必须通过建立符合 GMP 标准的设施，才能实现适用于临床前研究的抗体药物规模化制备。而建造 GMP 设施的巨大投入，对于许多研究机构来说是难以承担的负担，也增加了抗 体药物转化的成本和风险，限制了许多在实验室中表现出潜在应用价值的抗体 进入临床前评估，成为了当前阻碍抗体药物转化研究进程的障碍之一。所以， 对于处在早期开发阶段的研究者，如何更快捷地实现符合临床药物质量标准的 抗体规模化制备，以完成各项临床前实验及安全性评价，成为了当前抗体药物 转化研究中一个亟待解决的问题。 本论文围绕解决这一限速性关键问题，以抑制肿瘤血管生长的，人源化抗 CD146单克隆抗体huAA98为切入点； 进行了适用于临床前研究阶段的， 非GMP 条件下，抗体中试规模下游制备工艺的探索，获得了主要研究结果如下： （1） 建立了抗体 huAA98 的下游制备工艺。 该工艺通过中空纤维微滤澄清、 亲和层析、 凝胶过滤层析、 中空纤维超滤等四个环节， 有效地去除了抗体huAA98 培养上清中的各种杂质，稳定获得了纯度高于 95%的抗体蛋白，满足了中华 人民共和国药典 （2010 版）关于蛋白质药物纯度的要求。 （2）首次提出了“管路化制备”这一概念，发明了一种全封闭管路化抗体 蛋白下游制备系统。我们通过将抗体药物下游制备过程所可能涉及的各工艺环 节，分别构建成相对独立的全封密模块；然后按照目标抗体的制备工艺顺序， 将相关模块进行顺序串连，构建成为无缝连接的管路化系统；进而通过在这一 封闭无菌的系统中，完成抗体下游制备全部工序的方式，实现了在非 GMP 实 验室环境中，制备符合临床药物质量标准抗体的目标。 （3）完成了多批次、规模逐级放大的抗体制备验证，达到了批次制备克级 抗体蛋白的中试规模。质控结果表明，通过该系统获得的成品抗体 huAA98， 几项主要残留指标均显著低于中华人民共和国药典 （2010 版）的规定（内 摘 要 III 毒素IgGlIgG2IgG4，实 际上IgG4几乎不能激活补体11, 13。抗体只有与抗原结合成复合物才能有效地 激活补体，激活过程通过抗体抗原复合物与补体成分Clq的结合所启动。补体激 活后可以产生多种生物学效应：如细胞裂解、免疫粘附及调理作用、促进炎症反 应、免疫调节作用等。 Fc受体介导的效应功能： 在许多免疫细胞的表面都能表达可结合抗体Fc段的 受体(Fc receptor，FcR)，细胞通过这些FcR的介导，执行多种重要的效应功能。 近年来已发现多种不同的FcR，所有FeR都含有一个可与Fc结合的多肽链，它与 一个或多个涉及信号传导的多肽链形成多聚体， 这些受体基本上属于免疫球蛋白 超家族。FcR依其所结合的抗体类别的不同可分为5种：Fc R(结合IgG)， Fc R(结合IgE)，Fc R(结合IgA)， Fc R(结合IgM)和Fc R(结合IgD)。在每一种 FcR中又存在分子结构的不同， 以罗马数字表示， 如： Fc R I(CD64)， 还有些FcR 分子结构相似但由不同的基因编码，以A，B，C表示，如：Fc R IIA等。目前 对于不同FcR介导的功能了解还不是很充分，仅发现不同的FcR具有多种激发性 效应功能，也可有抑制性功能，还涉及多种方面的转动功能。主要有：FcR介导 人源化抗 CD146 单克隆抗体的临床前转化研究 4 的吞噬功能， 抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody dependentcell mediated cytotoxicity，ADCC)，激发细胞代谢的变化和生物活性物质的释放，免疫调节作 用及Fc受体介导的转运功能17。 2.3 已上市抗体药物已上市抗体药物 截至2012年，在世界主要医药市场，已经批准了38个治疗性抗体药物，其中 美国及欧盟批准了34个，中国批准了3个，日本批准了1个7。其中6个鼠源抗体， 7个人-鼠嵌合抗体15个人源化抗体，10个全人源抗体，主要用于治疗肿瘤、自 身免疫性疾病、病毒感染和器官移植时的排斥反应等。同时，还有200多种治疗 性抗体正在进行不同阶段的临床试验，1000多种治疗性抗体处于临床前研究18, 19。2008年，抗体药物销售额已经突破200亿美元，到2010年全世界药物市场排 名前20的药物中， 5种都是单克隆抗体药物， 分别为： Remicade、 Humira、 Avastin、 MabThera、Herceptin，这5种药物的销量均超过了40亿美元IMS公司网站。 表1 世界范围内已批准上市抗体药物7FDA, SFDA网站 序序 号号 商品名商品名 学名学名 抗体类型抗体类型 抗原抗原 适应症适应症 获批年份获批年份 制造商制造商 1 Orthoclo ne OKT3 Muromom ab 鼠源 IgG2a CD3 预防肾移植中的 急性器官排斥 1986 (FDA) 强生（Ortho Biotech Inc） 2 Centoxin Nebacuma b 人 IgM Endotoxi n 脓毒症 1991 (EMEA) 3 Reopro Abcixima b 嵌合 Fab 血小板 GPIIb/III a 受体 急性心肌缺血并 发症 1993 (FDA) 强生 （Centocor） 4 Panorex Edrecolo mab 鼠源 IgG2a EpCAM 结肠癌 1995 (EMEA) 5 Rituxan Rituximab 嵌合 IgG1 CD20 B 细胞非霍奇金 淋巴瘤 1997 (FDA) 1998 (EMEA) 基因泰克 （Genentech and Biogen Idec） 6 Zenapax Daclizuma b 人源化 IgG1 IL-2R/ CD25 预防肾移植中的 急性器官排斥 1997 (FDA) 1999(EM EA) 罗氏 （Hoffman-L a Roche） 文献综述 5 7 Simulect Basilixima b 嵌合 IgG1 IL-2R/ CD25 预防肾移植中的 急性器官排斥 1998 (FDA) 1998(EM EA) 诺华 （Novartis） 8 Synagis Palivizum ab 人源化 IgG1 RSV F 蛋白 呼吸道合胞病毒 (RSV)感染 1998 (FDA) 1999(EM EA) 阿斯利康 （Medimmun e） 9 Remicad e Infliximab 嵌合 IgG1 TNF 克罗恩病、类风 湿样关节炎等 1998 (FDA) 1999(EM EA) 强生 （Centocor） 10 TheraCI M/泰欣 生 Nimotuzu mab 人源化 IgG1 EGFR 头颈部扁平细胞 癌、神经胶质瘤 1999（古 巴） 、2005 （中国） （超过 20 个国家） 11 Herceptin Trastuzum ab 人源化 IgG1 Her2 乳腺癌 1998 (FDA) 2000(EM EA) 基因泰克 （Genentech） 12 Mylotarg Gemtuzu mab Ozogamic in 肿瘤抗生 素-人源化 IgG4 偶联 物 CD33 急性髓性白血病 2000 (FDA) 惠氏 （Wyeth/Pfiz er） 13 Campath Alemtuzu mab 人源化 IgG1 CD52 B 细胞慢性淋 巴细胞白血病 2001(FD A) 2001(EM EA) 健赞 （Genzyme） 14 Zevalin Ibritumom ab Tiuxetan 钇 90-鼠源 IgG1 CD20 B 细胞非霍奇金 淋巴瘤 2002 (FDA) 2004(EM EA) Biogen Idec/Spectrum 15 Humira Adalimum全人源TNF 克罗恩病、类风2002 雅培 （Abbott） 人源化抗 CD146 单克隆抗体的临床前转化研究 6 ab IgG1 湿样关节炎等 (FDA) 2003 (EMEA) 16 Xolair Omalizum ab 人源化 IgG1 IgE 中重度、顽固哮 喘 2003 (FDA) 2005 (EMEA) 基因泰克 （Genentech） 17 Bexxar Tositumo mab 碘 131-鼠 源 IgG2a CD20 非霍奇金淋巴瘤 2003 (FDA) 葛兰素史克 （Corixa/GS K） 18 Raptiva Efalizuma b 人源化 IgG1 CD11a 中、重度斑块性 银屑病 2003(FD A) 2004(EM EA) 基因泰克 （Genentech） 19 Erbitux Cetuxima b 嵌合 IgG1 EGFR 头颈癌、结直肠 癌 2004(FD A) 2004(EM EA) ImClone/BM S/Merck kGa 20 Avastin Bevacizu mab 人源化 IgG1 VEGF-A 多种实体瘤 2004 (FDA) 2005(EM EA) 基因泰克 （Genentech） 21 Tysabri Natalizum ab 人源化 IgG4 4-integr in 多发性硬化、克 罗恩病 2004 (FDA) 2006(EM EA) Biogen Idec/Elan 22 利卡汀 Metuxima b 碘131鼠源 F(ab)2 Hab18G/ CD147 肝癌 2006（中 国） 成都华神 23 唯美生 碘131嵌合 IgG 肺癌 2006（中 国） 上海美恩生 物 24 Lucentis Ranibizu mab 人源化 Fab VEGF-A 年龄相关性黄斑 变性 2006 (FDA) 2007(EM EA) 基因泰克 （Genentech） 文献综述 7 25 Vectibix Panitumu mab 全人源 IgG2 EGFR 转移性结直肠癌 2006 (FDA) 2007(EM EA) 安进 （Amgen） 26 Soliris Eculizuma b 人源化 IgG2/4 C5 补体 阵发性、睡眠性 血红蛋白尿症 2007 (FDA) 2007(EM EA) Alexion 27 Cimzia Certolizu mab Pegol PEG 化的 人源化 Fab TNF 克罗恩病、类风 湿样关节炎 2008 (FDA) 2009(EM EA) UCB, Inc 28 Simponi Golimuma b 全人源 IgG1 TNF 类风湿样关节 炎、银屑病、强 直性脊柱炎 2009 (FDA) 2009(EM EA) 强生 （Centocor Ortho Biotech） 29 Ilaris Canakinu mab 全人源 IgG1 IL-1 冷吡啉相关周期 综合症(CAPS) 2009 (FDA) 2009(EM EA) 诺华 （Novartis） 30 Stelara Ustekinu mab 全人源 IgG1 IL-12/ 23 斑块性银屑病 2009 (FDA) 2009(EM EA) 强生 （Centocor Ortho Biotech） 31 Arzerra Ofatumum ab 全人源 IgG1 CD20 慢性淋巴性白血 病 2009 (FDA) 葛兰素史克 （Glaxo Grp Ltd） 32 Actemra Tocilizum ab 人源化 IgG1 IL-6R 类风湿性关节炎 2010 (FDA) 罗氏 （Roche/Chu gai） 33 Prolia Denosuma b 全人源 IgG2 NF-KB 配体的 受体或 激活因 绝经后妇女骨质 疏松症 2010 (FDA) 2010(EM EA) 安进 （Amgen） 人源化抗 CD146 单克隆抗体的临床前转化研究 8 子 34 Removab Catumaxo mab 鼠源杂交 双特异 IgG EpCAM 和 CD3 上皮肿瘤引发的 恶性腹水 2009(EM EA) TRION Pharma 35 Benlysta Belimuma b 全人源 IgG1 B 淋巴 细胞刺 激因子 (Blys) 系统性红斑狼疮 2011(FDA ) 葛兰素史克 （Glaxo Grp Ltd） 36 Yervoy Ipilimuma b 全人源 IgG1 细胞毒T 淋巴细 胞抗原 4 (CTLA- 4) 转移性黑色素瘤 2011(FDA ) 百时美施贵 宝 （Bristol-My ers Squibb） 37 Adcetris brentuxim ab vedotin 嵌合 IgG1 抗体 cAC10 偶 联抗有丝 分裂剂 MMAE CD30 霍奇金淋巴瘤和 复发性间变性大 细胞淋巴瘤 2011(FDA ) Seattle Genetics, Inc. 38 Poteligeo Mogamuli zumab 人源化 IgG1 CCR4 T 细胞淋巴瘤 2012（日 本） Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd 通过对目前已上市抗体药物适应症的分析， 抗体药物的用途主要集中在以下 领域： 在肿瘤治疗方面的应用： 针对肿瘤的抗体药物能有效地降低传统肿瘤药物治 疗的不良反应， 目前批准上市的38个治疗性单抗中有18个是用于肿瘤治疗 （表1） ， 在进入临床的单抗中也有44用于肿瘤。 这些治疗性抗体的研制主要是针对那些 与肿瘤发生、发展相关的靶分子，如治疗非霍奇金淋巴瘤的抗CD20的嵌合抗体 Retuximab20和抗HER-2的人源化抗体Herceptin21，以及针对肿瘤靶位 VEGF-A、EGFR、CD22等开发研制的人源化抗体22。这些靶分子在正常组织 或细胞中就存在一定的表达，但在许多肿瘤细胞中过度表达，因此可作为肿瘤特 异的标志物。还有一些人源化单抗是通过携带抗癌药物如毒素、细胞毒药物、放 射性核素、酶、化疗药物等分子而发挥作用。这样偶联而成“生物导弹“，从而 达到特异性杀伤癌细胞的作用。 在器官移植中的应用：目前，有3个抗体药物（表1），应用于器官移植后的 抗排斥治疗。器官移植后发生的移植排斥和移植物抗宿主反应均是同种免疫反 文献综述 9 应，其治疗原则是免疫抑制。如何避免和尽可能减轻移植后发生的排斥反应，以 保护移植器官的功能，是器官移植成败的关键。近年来，利用抗体药物作为实体 器官移植的诱导治疗逐渐增加。如最早批准(1986年)进入美国市场的治疗性抗体 类药物抗CD3单抗OKT3即被用于肾、心脏、肝脏移植排斥的逆转。类似功能的 治疗性抗体还有1997年上市的Zannpax及1998年上市的Simulect抗体， 它们都是针 对CD25靶向抗原的治疗性抗体23。 在自身免疫性疾病方面的应用：目前，有12个抗体应用于自身免疫疾病的治 疗中（表1）。在对自身免疫疾病的治疗中，单抗药物通过清除激活的细胞，阻 滞其功能， 或将升高的促炎细胞因子水平降至正常水平而抑制过度的免疫病理学 反应。现有的研究表明，抗体对类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、多 发性硬化、 克罗恩氏病等疗效较好22, 23。 Infliximab是由美国Johnson和Centocor 联合开发的嵌合型抗TNF 单抗， 对类风湿性关节炎有很好的疗效23。 2007年2 月，全人序列单抗药物Humira获美国FDA批准用于治疗克罗恩氏病24，这是该 药的第4个免疫性疾病适应证。Humira也是目前临床治疗克罗恩氏病的唯一生物 制剂。克罗恩氏病是一种严重的慢性消化道过敏性疾病，症状包括腹泻、腹痛以 及发烧等，发病时全无征兆，病人十分痛苦，对于该病尚无成熟的治疗方法和药 品。 Humira的出现， 为克罗恩氏病的治疗带来了新的希望， 并可由患者自己使用。 在心血管疾病方面的应用：心血管疾病是危害人类健康的常见疾病，其发病 率多年来一直位居人类疾病之首。血小板在血栓形成，特别是在动脉血栓形成过 程中起着重要作用。美国FDA于1994年批准了第一个人-鼠嵌合Fab抗体ReoPro上 市25，ReoPro已被广泛应用于多种心血管疾病治疗，主要用于预防冠状动脉成 形术后的再狭窄。其他针对心血管疾病的抗体，还有抗补体C5的Soliris。 在感染性疾病方面的应用：感染性疾病的预防主要是以疫苗为主，而感染性 疾病的治疗主要以特异性抗病毒抗体为主。近年来研究表明，在HBV、HCV、 HIV等病毒感染性疾病中，人源化抗体显示了较好的应用前景26。商品名为 Synagis的抗呼吸道病毒(RSV)感染的抗体在美国已经上市23，为人源化的基因 工程抗体。抗CD4的单抗hu5A8能降低非人灵长类的CD4T细胞和巨嗜细胞被 HIV-1病毒的感染程度， 因此， hu5A8极有可能成为治疗HIV的有效抗体药物27。 3. 抗体药物的发展趋势抗体药物的发展趋势 3.1 发展人源化甚至全人抗体发展人源化甚至全人抗体 抗体药物经过近30年的开发和临床应用， 目前已经达成了一个广泛认同的共 人源化抗 CD146 单克隆抗体的临床前转化研究 10 识抗体产业化发展趋势是：鼠源抗体到人-鼠嵌合抗体，到人源化抗体甚至 全人抗体。目前人源抗体的制备主要有4种技术：EB病毒转化人B淋巴细胞、人 人杂交瘤技术、抗体库技术(包括噬菌体抗体库、合成抗体库、核糖体展示等) 和转基因动物28。关于抗体人源化及全人抗体制备技术，将在后续部分详细阐 述。 3.2 改变抗体分子大小改变抗体分子大小 完整抗体的分子量在150 kDa左右，很难穿透血管进入实体瘤，而且从体内 清除也慢，一些抗体片段如Fab、单链抗体(ScFv)、Dibody、Minibody由于去除 了抗体的恒定区或Fc，因此在体内较快被清除，有较好的肿瘤血液比(tumor blood ratio)，它们适合于放射免疫显像或放射治疗29。为了增加抗体片段的稳 定性，往往在轻、重链间引入连接肽(1inker)或二硫键。连接肽的长度和组成、 二硫键的位置需要通过计算机辅助设计确定，以减少对抗体特异性、亲和力和表 达量的影响。此外，Ablynx公司提出纳米抗体(Nanobody)的概念，这是以骆驼抗 体重链可变区为框架的抗体。它是人IgG分子的十分之一，稳定性好，制备容易。 目前已有3种纳米抗体正在进行临床试验30, 31。 3.3 增加抗体亲和力增加抗体亲和力 对于治疗性抗体来说，抗体亲和力的提高有助于降低用量和毒副作用，此外 也降低治疗费用。抗体亲和力成熟常利用噬菌体展示(phage display)或酵母展示 (yeast display)技术，基本上可以分为两大类：一类是通过构建CDR或可变区随机 突变的大容量库，然后筛选出高亲和力的突变体。也可以通过DNA改组(DNA shufling)、链改组(chain shufling)、错配PCR等方法提高抗体亲和力；另一类是模 拟体内亲和力成熟，构建集中突变或热点突变的小容量库，也可以在6个CDR每 个位置上进行单点突变，或在可变区的某些位置上进行随机突变，然后筛选高亲 和力的突变体。几种方法结合起来可以大大提高抗体亲和32, 33。 3.4 改进抗体的改进抗体的ADCC或或CDC效应效应 在人类的效应细胞上，存在几种Fc Rs，它们是Fc R I（CD64）、Fc R II （CD32）和Fc R （CD16）。Fc R II和Fc R 还有A、B 2个亚型。Fc R IIA有2个天然的同种异型，Fc R A有3个同种异型，不同的受体和它们的 亚型与IgG的亲和力是不同的，触发抗体的效应功能也是不同的。Fc R I以高亲 和力结合IgG单体，而Fc R II和Fc R 与IgG的亲和力较低，只能有效地与多 聚免疫复合物反应。ADCC效应是通过抗体结合到NK、M 等效应细胞表面Fc 文献综述 11 受体上，激发吞噬作用或靶细胞裂解。而IgG与Fc Rs的相互作用依赖于Fc区域 的寡糖及在铰链区和CH 区的某些氨基酸残基。 有报道从Fc的N-糖基化核上除去 岩藻糖，可以大大改善与Fc Rs的结合，促进ADCC活性34。低岩藻糖化的IgG 显示增加与Fc R A的结合，ADCC活性也提高。2001年，Shields等对人IgG1 Fc与Fc Rs及各亚型的结合部位进行了突变分析，确定了在S298AE333A K334A 3个位置上都突变的突变体与Fc R A的结合增加，相应的ADCC活性 也增加35。该突变体去岩藻糖后，ADCC活性进一步增加，但这些均为体外实 验结果，尚未被体内实验证实。 CDC效应是依赖于补体成分C1qs与抗体铰链区和CH2的结合，激发细胞的补 体级联反应系统，杀死靶细胞。IgG恒定区的定点突变和结构域转换研究结果表 明：CH2结构域对CDC的功能是非常重要的。据此，Indusogie等用丙氨酸扫描突 变技术研究了美罗华(Rituxan)的CDC功能36, 37，找到CH2结构域中与Clq结合 的位点Asp270，Lys322，Pro329和Pro331，它们在空间结构上非常接近，进一步又确 定C1q结合区边缘的二个氨基酸Lys326和Glu333，经改造可以增加与Clq的结合和 CDC效应。人IgG1亚类在ADCC和CDC反应中是最有效的，因此适合构建针对病 原体和肿瘤细胞的治疗性抗体。而人IgG4不能激活ADCC和CDC，适用于显像诊 断和阻断分子间相互作用。 3.5 改变抗体的药代动力学改变抗体的药代动力学 IgG1的血浆半寿期取决于它与FcRn的结合，一般在pH 6.0时结合，在pH 7.4(血浆pH)时不结合。通过对两者结合位点的研究，改造IgG上与FcRn结合的部 位，使之在pH 6.0时结合增加，而不是在pH 7.4。此外，Dall Acqua等发现在 Fc-FcRn结合界面上252， 254， 256， 433， 434和436位引入突变能改善结合。 Hinton 等也发现T250Q和M428L 2个突变体分别使与FcRn的结合增加3倍和7倍38。同时 突变2个地方，则结合增加28倍。在恒河猴体内，M428L或T250Q/M428L突变体显示 血浆半寿期增加2倍。改变抗体药代动力学的另一种方法是PEG修饰，它可以降 低免疫原性、增加抗体在体内的半寿期、提高稳定性、改变抗体的分布(如：从 血浆进入间质)39。 3.6 引入新的效应功能引入新的效应功能 裸抗体的效应功能是有限的，而且有些个体由于Fc Rs的多态性，对ADCC 效应不敏感，因此需要考虑通过交联或融合引入细胞毒性物质，例如：放射性同 位素、药物、毒素、细胞因子等。已被FDA批准的Mylotarg就是抗CD33抗体与 calicheamycin的交联物，用于白血病治疗，这种情况下抗体分子仅起靶向作用 人源化抗 CD146 单克隆抗体的临床前转化研究 12 40。 3.7 双特异性抗体双特异性抗体 双功能抗体可以结合2个不同的抗原表位，大多数情况下是2个不同的抗原。 早期的双功能抗体一个抗原结合部位是针对肿瘤相关抗原，另一个是靶向T细胞 上的CD3分子或Fc R，促使免疫系统的效应细胞杀伤肿瘤细胞，例如：抗CD30 抗Fc R 、 抗CD30抗Fc R I双功能抗体治疗非何杰金氏淋巴瘤， 抗HER2 抗Fc R I双功能抗体治疗乳腺癌。最近又有一些新的双功能抗体出现，它们 一个结合部位是针对高亲和力的IgA（Fc R I，CD89），体内外实验结果显示： 靶向Fc R I不仅抗肿瘤的效果与Fc R I双功能抗体一样好，而且对某些效应细 胞(如粒细胞)，Fc R I双功能抗体更有效41。 3.8 抗体抗体-细胞因子融合蛋白细胞因子融合蛋白 细胞因子能有效激活免疫细胞，如：单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、 树突状细胞、T细胞和B细胞。但同样会引起严重的副作用。如果能将它们集聚 在靶部位，就可以降低细胞因子治疗时的系统性毒副作用。抗体-细胞因子融合 蛋白就是利用抗体的靶向性达到上述目的的。 各种细胞因子可以连接到完整抗体 或单链抗体的N端或C端。抗体-IL-2融合蛋白在小鼠模型上显示出抗各种肿瘤的 效果，不仅肿瘤缩小，而且能降低肿瘤转移42。它们的抗肿瘤效应可能来自于 浸润的效应细胞的激活，如果存在IgG Fc，则有可能通过细胞因子受体和Fc R， 这样不仅细胞因子激活免疫细胞，而且可同时提供Fc R引起的ADCC，进一步 增加抗肿瘤效应。为了增强抗肿瘤作用，有报道同时用2个不同的细胞因子，如 IL-2和IL-12，或IL-4和GM-CSF，它们可以串联在抗体重链的C端，或一个细胞 因子融合在抗体重链或轻链的C端，另一个融合在N端。体内外实验模型上显示 出增加了抗肿瘤效果，但这么大的分子在体内能否进入实体瘤还需要评价。另据 报道细胞因子-抗HER2融合蛋白在体内可以提高HER2胞外段蛋白组成的疫苗的 反应，提示融合蛋白的一种新用途43。 4. 靶向肿瘤血管治疗与靶向肿瘤血管治疗与 CD146 抗体抗体 4.1 肿瘤血管靶向治疗肿瘤血管靶向治疗 自从Judah Folkman教授于1971年提出肿瘤生长浸润依赖于肿瘤组织内血管 的形成的观点之后44，肿瘤血管生成逐渐成为近几十年肿瘤研究领域的热点问 题。 有功能性血供是肿瘤生长及转移的关键， 如果没有血管系统提供氧气和养料， 文献综述 13 实体瘤的增长不会超过lmm3。肿瘤细胞诱导的新生血管结构存在缺陷，分布方 式无序，也无完整的微循环功能，与宿主正常组织的血管存在较大差异，属于未 分化成熟的血管。肿瘤新生血管越多，肿瘤生长增殖越快，发生转移的机率就越 高。肿瘤血管新生是肿瘤生长和转移的关键，调节肿瘤血管的生长就可能控制肿 瘤的生长45。鉴于其在肿瘤发生发展中的重要作用，肿瘤血管已成为抗肿瘤治 疗的一个重要靶点。 针对肿瘤血管的治疗是针对肿瘤血管供应， 而非传统的直接针对肿瘤细胞的 细胞毒性药物。根据作用血管机制的不同，抗肿瘤血管制剂(Vascular-targeted agents，VTAs)分为两种46：一是抗血管新生制剂(antiangiogenic agents)，即抑 制肿瘤新生血管新生的过程，从而抑制肿瘤新生血管的生成。适用于处于早期阶 段或无系统性转移的实体瘤的治疗。采用的策略包括抑制基底膜降解；直接抑制 内皮细胞增殖；抑制血管生长因子活化；抑制内皮细胞特异性整合素生存信号 等。应用于处于早期阶段的肿瘤或无症状的转移瘤的预防，已有许多候选药物在 进行临床各期实验。另一种方法即选择性地破坏肿瘤血管系统，被称为肿瘤血管 阻断制剂(Vascular-distrupting agents，VDAs)。利用肿瘤血管和正常组织血管存 在的差别选择性地破坏肿瘤血管或借助能够特异结合肿瘤血管的配体将毒素、 凝 血诱导剂、凋亡诱导分子等运送到肿瘤血管，快速而有选择性地损坏或堵塞已构 建完成的肿瘤血管，对于治疗血管已形成肿瘤有显著的疗效。但是，这两种效应 可能会在某个药物重叠出现47。 一、肿瘤新生血管新生抑制剂治疗的特点：肿瘤血管新生是一系列复杂的现 象和过程，由肿瘤细胞和内皮细胞(endothelial cell)通过旁分泌相互作用而引发 的，肿瘤血管生长是在特定时段、特定环境下由内外因素引起的一种由一系列细 胞因子介导的瀑布式生化反应过程。这一过程受多种血管新生因子(angiogenic foctors)和血管新生抑制因子(anti-angiogenic factors)的调控，即血管调控“开关” 学说(angiogenic switch)。通常情况下血管新生抑制物占优势而抑制血管新生，但 许多种生物信号可能转换这个“开关”为血管生长状态，如低糖时可诱导血小板 衍生生长因子B产生或缺氧和或基因改变，都会诱导血管新生因子生成从而使 肿瘤进入血管生长状态48。肿瘤细胞释放血管生长诱导因子如VEGF和bFGF， 黏附到内皮细胞并使之激活，激活的内皮细胞传递信号至细胞核产生酶，如基质 金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)，这些酶类破坏血管的细胞外基质， 使内皮细胞侵入基质并分化， 增生的内皮细胞沿酶类在基质中形成的空洞向生长 刺激因子迁移，黏附分子和整合素介导此过程，酶被继续释放以溶解周围组织； 被激活的内皮细胞表面有黏附受体整合素3介导血管的分化、成熟和存活；新 的内皮细胞串先形成管状结构再形成血管， 单个血管在连接成环状或网状以保证 人源化抗 CD146 单克隆抗体的临床前转化研究 14 血液循环；内皮细胞沉淀形成基底膜并分泌生长因子，比如PDGF，它吸引支持 细胞如外皮细胞来提供支持结构聚集形成稳定的新血管， 于是血管开始向最始释 放诱导因子的组织输送血液48, 49。 抗肿瘤血管新生的方法主要是针对新生血管形成的过程， 阻断以上其中一个 或几个环节来阻止肿瘤生长，限制肿瘤转移的潜力，可达到抗肿瘤血管新生的效 果50。抑制肿瘤血管新生的治疗策略主要包括：（1）通过阻断血管新生的诱 发因素和增加内源性血管抑制物表达来关闭血管发生的“开关”。（2）通过抑 制血管新生刺激信号与其受体的结合、干扰细胞间的信号传递，下调血管生长因 子的表达及与内皮细胞受体的结合； 抑制血管新生激活因子来阻止内皮细胞的扩 增；（3）通过抑制细胞外基质和基底膜的降解。将有关内皮细胞的基质金属蛋 白酶作为治疗的靶点，同样可以抑制肿瘤血管的生成。（4）抑制微管形成来对 抗内皮细胞的迁移。（5）其他，如抗血管新生的免疫基因治疗、诱导肿瘤内皮 细胞的凋亡、 以及近年来受到广泛重视的利用RNA干扰技术进行的抗肿瘤血管治 疗等。 对于血管新生抑制剂的治疗的主要作用靶点包括以下几个方面： （1）阻断血管新生因子。肿瘤血管新生过程中各种促血管新生因子的作用 环节，均可视为肿瘤血管抑制治疗的靶点。VEGF、bFGF是最早发现的作用最强 的促肿瘤血管新生因子，也是肿瘤血管治疗中的主要靶分子。VEGF是一种高度 特异的血管内皮细胞有丝分裂原，是目前所知作用最强的促血管生长因子，还是 最强的增加血管通透性的因子， 它主要与内皮细胞上的两种受体Flt-1、 Flk-2结合 发挥促进内皮细胞的分裂增殖、迁移和血管重建的作用。由于VEGF在血管新生 中发挥主导性的作用，因此多数研究将VEGF或其受体作为治疗的靶点。如抗 VEGF单克隆抗体可以直接抑制VEGF的作用，对结直肠癌、肝癌、乳腺癌等具 有良好的疗效。利用核酶、反义寡核苷酸或RNA干扰技术可有效地封闭VEGF的 作用通路可达到抗血管新生的目的51。由于VEGF的产生受到某些基因调控， 因此用这些基因的反义基因转染肿瘤细胞亦可达到同样效果，如利用反义的 C-Src转染瘤株后可降低VEGF的表达和活化，而用野生型p53基因转染的癌细胞 也 降 低 了 VEGF 表 达 的 水 平 。 最 近 Genentech 的 抗 VEGF 单 克 隆 抗 体 Avastin(bevacizumab)与5一氟尿嘧啶亚叶酸联合治疗转移性直肠结肠癌被证明 具有良好的临床效果52。 （2）抑制血管内皮细胞增殖和或促进其凋亡。此类药物可直接抑制激活 的血管内皮细胞增殖和或促进其凋亡，其中的代表为TNP-470。TNP-470是烟 曲霉素的衍生物，具有强烈抑制内皮细胞增殖的作用。研究表明TNP-470可以抑 制蛋氨酸氨基肽酶-2活性，抑制内皮细胞增生、移动和管腔形成，且细胞毒性作 文献综述 15 用很小，体内实验中均显示了抗肿瘤血管生长的活性。TNP-470是于1992年第一 个进入临床试用的血管新生抑制剂，治疗多种人类肿瘤，对胃癌、大肠癌等具有 明显疗效，可抑制肿瘤生长和转移53。血管抑素(angiostatin)是血纤维蛋白溶酶 原上一段38kD的片断，是一种内源性血管抑制物，已经证实它能抑制小鼠肿瘤 和移植瘤的生长54。血管抑素特异性地作用于增殖状态的内皮细胞，使内皮细 胞萎缩、退变，它可以对抗bFGF促血管内皮细胞生长的作用，抑制内皮细胞的 迁移并促进其凋亡。 （3）阻断内皮细胞表面整合素。内皮细胞表面的某些整合素可与细胞外基 质结合，促使内皮细胞向肿瘤细胞迁移，从而生成新的血管。一些药物可阻断以 上过程， 发挥抗肿瘤的作用。 Vitaxin是整合蛋白(integrin) 3人源性单克隆抗体。 亚型整合素介导的内皮细胞与细胞外基质的相互作用是血管新生的必要环节。 3抗体在动物试验中，有很好的抗肿瘤生长和转移的作用。I期临床试验中， 14例晚期胃癌患者接受了治疗，8例患者病情没有在发展或肿瘤缩小，且未发现 有明显的副作用。目前正在期临床实验，主要针对晚期直肠癌患者，结果 显示在85天内病情并未继续发展， 每3周服用200mg即可维持有效治疗浓度。 Shen 等比较了抗3单克隆抗体与蛇毒三黄素的抑制血管生长作用， 表明三黄素的作 用较抗体高20-30倍55。 （4）阻断内皮细胞降解周围基质：MMP在细胞外基质的塑形中具有重要作 用， 细胞外基质的塑形是血管形成病理生理过程和肿瘤生长转移过程中关键的步 骤56。20世纪80年代，许多学者开始研究基质金属蛋白酶的抑制剂，此类抑制 剂可以与金属蛋白酶的锌指结构结合而抑制其活性， 从而防止细胞外基质的降解 和基底膜的破坏，发挥抑制肿瘤血管新生的作用。而且MMP及其基质金属蛋白 酶 抑 制 剂 (matrix metalloproteinase inhibitors ， MMPI) 、 纤 溶 酶 原 激 活 物 (plasminogen activators，PA)及其抑制剂PAI是两个在介导微血管新生和肿瘤转移 关系方面具有重要作用的系统。Bartimastat是最早合成并应用于临床试验的 MMPI，是一种与作用底物链结构相似的异羟钨酸衍生物，口服利用率低，仅限 于胸腔或腹部直接注射。动物试验中，向荷人卵巢癌的裸鼠腹腔注射该药后，可 以通过抑制肿瘤细胞产生的MMP明显抑制肿瘤的生长，且动物生存期较对照组 延长5-6倍。治疗后的肿瘤体积明显缩小，无明显血管形成。人工合成的MMP衍 生物还有AG-3340、Marimastat等。2000年首次报道的Arresten，是血管基膜源性 的血管形成抑制剂，主要是通过抑制内皮细胞的增殖、分化和微管的形成来达到 血管抑制的作用。它的活性受内皮细胞上整合素1调节。将人的肿瘤移植到 裸鼠上，Arresten能抑制其的生长，同时它还能抑制小鼠转移瘤的生长57。 （5）其它不同的机制。如抑制微管形成来对抗内皮细胞的迁移，如抗血管 人源化抗 CD146 单克隆抗体的临床前转化研究 16 新生的免疫基因治疗、 以及近年来受到广泛重视的利用RNA干扰技术进行的抗肿 瘤血管治疗等。 二、血管阻断作用特点及血管阻断制剂：肿瘤血管阻断制剂，是可以快速而 有选择性地引起肿瘤即存血管损伤的药物。Juliana Denekamp观察到物理性阻断 实体瘤血供包括血管结扎和经导管动脉栓塞， 破坏肿瘤血管可使大鼠肿瘤缩小的 现象，推测靶向血管的药物可能引起肿瘤内部血管破坏，提出靶向肿瘤血管的药 物可用于肿瘤治疗的观点58, 59。随后，由肿瘤血管特异的抗体所介导的毒素 引起大鼠肿瘤萎缩的实验现象60，以及抗微管药物具有内在抗血管活性的事实 61证明了这一观点的正确。 与抗血管新生制剂旨在阻止血管出芽增殖生成新生血管这一链式反应过程 不同的是，VDAs作用机制是破坏实体瘤血管内皮细胞导致肿瘤细胞缺乏养料和 氧气而死亡，引起肿瘤内大部分已构建成熟血管和芽生毛细血管的阻塞，迅速导 致肿瘤的大面积坏死62。动物肿瘤试验表明对于已形成较大体积的肿瘤，血管 阻断剂则更有效63, 64，可引起肿瘤广泛的中心性坏死，最大可达到肿瘤的 95，而处于肿瘤块边缘一薄层肿瘤细胞常常能够幸免。VDAs在肿瘤中心区域 作用明显可能是此区域有较高的间质压力容易使血管塌陷。 目前，已经研发出新型的选择性的阻断发育成熟肿瘤血管的制剂，并有很多 专门以阻断肿瘤血管血供为目标的治疗方法处于研究阶段。VDAs按照药物形式 以及作用方式的不同分为两类，配基导向VDAs(1igand-directed VDAs)和小分子 VDAs(small molecule VDAs)。 （1）配基导向VDAs：配体靶向性VDAs将靶向分子(target)与效应分子 (effector)通过化学偶联连接在一起，利用靶向分子将效应分子运送到肿瘤血管引 起血管内凝血或内皮细胞死亡。 很多治疗策略是能够与肿瘤细胞中选择性高表达 的标志分子结合的多肽或抗体， 也包括一些能识别肿瘤血管高表达生长因子受体 的生长因子(如VEGF)，通过识别肿瘤血管的效应分子，导致内皮细胞的破坏。 与正常组织血管相比，很多分子在肿瘤血管中过度表达，如参与血管形成和血管 重构的分子， 由肿瘤细胞和肿瘤浸润组织的细胞释放的炎症介质诱导的细胞黏附 分子(如IL-1)和引起肿瘤血管内皮细胞表面血栓形成前的变化的相关分子等。血 管靶向肽靶向结合上调表达的效应分子， 直接诱导或通过杀死内皮细胞间接引起 血栓形成，调动机体防御系统袭击肿瘤血管，引起内皮细胞形态变化阻断血管血 流62。 （2）小分子VDAs：目前研制的小分子VDAs不能特异地定位于肿瘤内皮， 而是利用肿瘤内皮和正常组织内皮的差异而实现其选择性； 作用机制是断裂迅速 增殖的、未成熟的依赖微管骨架来维持细胞形态的血管内皮细胞。小分子VDAs 文献综述 17 一般分小分子微管破坏类药物和小分子细胞因子诱导剂。 （a）微管破坏类药物：微管破坏类药物通过破坏内皮细胞的微管蛋白，最 终通过发挥抑制内皮细胞有丝分裂和抗血管效应的双莺作用阻滞细胞分裂周期 中纺锤体的形成(有丝分裂阻滞)，并减少肿瘤血管血流65。许多药物，如秋水 仙碱类药物和长春花碱类具有较窄的治疗窗， 而CA4是第一