实验四酵母RNA提取.ppt

酵母RNA的提取,1、实验目的,1、掌握稀碱法提取RNA的原理和方法 2、学习和了解其它提取RNA的方法和原理,2、实验重点和难点,离心机的使用 提取RNA的实验原理,3、实验原理,一般的生物细胞中同时含有DNA和RNA，在酵母中RNA比DNA的含量高得多， RNA（2.6710.0%），DNA则少于2(O.03O.516)，在实验室常用酵母作为RNA提取的材料。若要制备具有生物活性的RNA，可采用苯酚法、去污剂法和盐酸胍法等，最常用的是苯酚法提取RNA；若对生物活性没有要求，则可使用浓盐法，稀碱法等。工业中用稀碱法或浓盐法，主要用于制备核苷酸的原料.,苯酚法：组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。 浓盐法：在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA 释放出来，再利用等电点（pH为2.02.5）沉淀。此法易掌握，产品颜色较好。盐浓度需要控制，太低，RNA不易从细胞中释放出来，太高，细胞急剧收缩不利于抽提。一般80120g/L为宜。,稀碱法：利用细胞壁在稀碱条件下溶解，使RNA释放出来，这种方法提取时间短，但RNA 在稀碱条件下不稳定，容易被碱分解； 本实验采用的稀碱，既可加速细胞的破裂，又可增大 RNA的溶解度。当碱被中和后，可用乙醇(或者异丙醇）将RNA沉淀，或用等电点沉淀RNA(应严格控制pH,缓慢调),此为 RNA的粗品。,核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。,（1）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。 （2）磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀(NH4)3PO412MoO3,有还原剂存在时，形成蓝色钼蓝。,(NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4 H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 MoO3（钼蓝） 还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值，当无机磷含量在125g 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1g RNA磷相当于10.5 g RNA。DNA的含磷量平均为9.9%。,（3）地衣酚(苔黑酚）显色法：RNA与酸共热时降解，形成戊糖，继而形成糠醛（-呋喃甲醛），糠醛与地衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应，形成鲜绿色复合物，可用比色法测定。当 核糖核酸浓度在 10100g/ml 范围内，其浓度与吸光度成线性关系需要FeCl3或Cu2+作催化剂。,4、实验操作,(一)RNA的提取 （1）称5g干酵母粉于150 ml三角烧瓶中，加25ml O.2的 NaOH，沸水浴中搅拌提取20 min。冷却后滴加乙酸使其略偏酸性，pH约5-6，目的是去除蛋白质。 （2）离心(4000 rmin，13 min)，去除沉淀。上清液冰浴。 （3）向上清液中加入20 ml（约上清液的两倍体积）95乙醇，稍搅拌后静置（冰浴约10min）。待完全沉淀后离心(4000 rmin，15 min) ，去上清液。 （4）沉淀用95乙醇洗两次（如沉淀浮起需再次离心），每次约10mL;用乙醚洗两次，每次10mL。目的是去除脂溶性物质和水，乙醚的沸点比乙醇的低，所以最后加乙醚有利于沉淀的干燥。,(二)RNA的鉴定 取沉淀约1g，加10 ml 10H2SO4沸水浴中加热30 min。 （5）嘌呤碱 取水解液2mL加入2mL浓氨水，然后加入约1mL 5%硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。（慢慢加入嘌呤碱时，沉淀上浮，摇匀，沉淀下沉） （6）核糖 取1支试管加入水解液0.5mL、1mL苔黑酚三氯化铁浓盐酸溶液。放沸水浴中2分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。时间久了会有黑色沉淀，是浓度高，产物结晶出来了。,5、注意事项,避开磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围2070，防止RNA 降解。在90100条件下加热可使蛋白质变性，破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶，有利于RNA 的提取。 在调pH 值时，一定要缓慢小心，且要在低温下进行。 在洗涤时，要用乙醇洗涤，且不可用水洗，否则将导致RNA 部分溶解而造成损失，降低RNA 提取率。,提取 RNA 时必须用沸水浴，并经常搅拌，NaOH 必须实现预热。 用乙酸调 pH56 必须有，目的可以除去一些杂质。 最后过滤前必须将乙醇沥干，不能带水，否则 RNA 会粘在滤纸上，