植物基因组大小测量方法.ppt

植物基因组大小及其测定方法,报告人：张丽,目录,1.植物基因组大小 2.决定其大小的因素 3. 测量方法,细胞是不停地进行着维持植物生存所必须的基本代谢活动的生命小宇宙,小宇宙当中的大部分代谢活动受制于细胞核.细胞核是生命赖以维持的基本装置, 细胞核是携带绝大部分遗传物质（DNA）的主要载体。,植物基因组大小,估计细胞核内的DNA 含量常用C 值(C-value)描述, DNA C-值指的是一个物种配子核中没有复制时的DNA 含量，而一个物种的单个染色体组的DNA含量称为基因组大小。该值对每种生物而言是一个常数(constont)，且具有种的特征(characteristic)。由于这两个词都是以 C 开头，所以传统地基因组大小又称 DNA C-值。,迄今为止, 已建立起含有5150 种植物的DNA C 值数据库包括被子植物、裸子植物、羊齿类、苔藓类以及藻类等。在被子植物中, 已知最小的基因组发现于螺旋狸藻(Genlisea maragretae Hutch.), 基因组大小为63 Mb; 最大的基因组为百合科的四倍体贝母(Fritillaria assyriaca Baker.),基因组大小为127Gb , 两者相差约2000倍。,由此可知，在真核生物中，不同种类的生物的基因组的大小变化范围非常大。由于真核生物的基因位于 DNA 上，所以人们很自然地就会认为，进化地位越高、结构越复杂的生物需要的基因就越多，因此其基因组中应该含有更多的DNA，即它的基因组就应该越大。,然而，越来越多的观察表明，这个假定是不成立的。例如百合基因组的大小是重要的粮食作物水稻的 200多倍。所以一种生物的基因组大小同该种生物的结构复杂性或其在进化上所处的地位高低无关，这种现象被称为 C 值佯谬。,决定因素,C 值佯谬现象困扰了人们半个多世纪。随着越来越多的真核生物基因组的测序完成，人们发现基因组的绝大部分 DNA 序列不是用来编码蛋白质的，而是以重复序列(主要是转座元件)为主的非编码序列。这一发现在一定程度上解释了 C 值佯谬现象，,既然重复序列决定了真核生物基因组的大小，那么是什么因素决定了重复序列的产生和积累呢?目前有两个主要的假说来解释真核生物基因组中重复序列的积累。,第一个假说是“突变 漂变”模型 (mutation drift models)。这个假说认为基因组中的重复序列是没有任何用处的，这些 DNA 序列是在随机的遗传漂变过程中固定下来，而基因组只是被动地携带它们。最终一种生物的基因组大小就是其所能忍受的最大限度。,第二个假说是“适应性(adaptive)”理论，这个假说认为基因组中的重复序列尽管不能编码蛋白质，但是它们可以直接或者间接地对表型产生影响，进而产生适应性。,根据这个理论，基因组大小的差异反映的是不同种生物的不同的适应性需求，或者说是作用在不同种生物上的自然选择效力的差别。,作为以上两个假说的补充，还有两个假说也解释真核生物基因组中非编码序列的积累，其中之一认为真核生物基因组的大小是由该基因组删除非编码DNA 序列的能力决定的。,另外一个假说则把目光集中到了真核生物基因组的主要成分转座元件身上。由于基因组利用小 RNA 来调控转座元件扩增的机制被揭示，这个假说认为:转座元件的转座(扩增)效率决定着基因组的大小。,尽管至今还没有任何一种假说能够完美地解释基因组中重复序列的积累，但很可能是以上各种假说中所提到的机制综合作用的结果，决定了真核生物基因组的大小。,意义,研究物种的基因组大小(C 值)为以下几个方面提供理论依据: (1)作为AFLP 引物中选择性碱基个数确定的依据, 若基因组较大, 则选择性碱基相应地增加;,(2)与微卫星的扩增效率相关, 主要是由于大的基因组稀释了靶位点在基因组中所占的比例, 致使引物与靶位点结合的几率降低; (3)作为细胞核大小、花粉粒直径等表型的预示值, 基因组大小与细胞核大小、花粉直径等表型性状成正相关。,(4)作为生态与环境的预示值, C 值与植物的生活史、地理分布、物候期、单位面积生物量、对生长环境的敏感度(如温度和湿度的变化)等紧密相关,还能预测长期的变化(诸如全球变暖)所引起的植被改变;,(5)利用推断的C 值来揭示古生物学的趋势,例如, 根据化石细胞的大小, 可以推断化石的DNA含量。在植物化石中, 气孔保卫细胞的大小也可以用来估计DNA 含量, 进而寻求C 值的进化趋势;,(6)C 值对物种保育具有重要的意义, 大基因组的物种往往存在更大的灭绝风险。虽然物种灭绝与基因组大小的关系是否存在还不明确, 但这种关系还是可能存在的。,检测方法,因此，测定植物的基因组大小不仅对于物种本身的细胞遗传学等研究具有重要意义，而且也为植物的基因组测序、基因组文库建立以及基因组学及其进化研究提供了不可或缺的基础资料。目前DNA C 值的检测方法最常用的主要有流式细胞术和实时荧光定量PCR等两种方法。,流式细胞术，是利用流式细胞仪对处在快速直线流动状态中的单细胞分析技术。是20世纪70年代发展起来的一项技术，综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各学科知识，它是一种自动分析技术。,功能,原理,流式细胞仪可在高速液流中对DNA 含量进行测定分析，检测器捕捉单细胞悬浮液中经DNA 特异性染料染色的细胞核被激发后所发射的荧光信号，荧光强弱与DNA 含量成正比，荧光信号经光电倍增管接受转换为电信号和可被计算机识别的数字信号接收，用直方图进行量化分析，通过与内参比较相对荧光强度从而估测出生物的基因组大小。,过程,取材清洗机械破壁离心（1500r/m 5min）弃上清避光4染色(20min) 上机测试软件分析倍性鉴定及数据分析。,注意事项,用流式细胞仪测定基因组大小，当测定方法和试材差异未被充分考虑时，经常会出现同一物种测定的结果不同，甚至同一实验室使用同一台仪器对不同批次试材的测定结果也会有所不同。我们在前人工作的基础上，更加注重材料的内标的选择及染色时间和系统稳定性等影响流式细胞仪测定结果精确性等因素的确定。,但目前国际上还没有一个统一的测量DNA含量的标准参照物，要进行DNA绝对含量测定，采用不同内标时结果存在误差，为避免非线性误差，理想的内标应该选用与待测物种基因组大小相近，但又能够相互区分、遗传稳定、基因组大小数据可靠且容易获得足够样品的物种。,再次就是取用相同苗龄和相同部位的新鲜幼嫩叶片，不经过冷冻和贮藏等环节，取材后立即制样，保证了样品活性，获得较完美的峰形图。此外，需要进行多次重复实验，始终把变异系数控制在小范围之间，最大限度地避免误差。,实时荧光定量PCR 是在PCR 定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程, 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,重要概念,在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,基线 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线， 光域值threshold的设定 一般讲PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。,Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光染料和荧光探针。 SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,1.SYBR Green I能结合到双链DNA的小沟部位2.SYBR Green I只有和双链结合后才发荧光。 3.变性时，DNA双链分开，无荧光 4.复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green I发荧光，在此阶段来采集荧光信号。,Taq man荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时同时加入一个特异性荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基因发出的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5- 3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。,优点,实时荧光定量PCR无需内标，实时荧光定量PCR技术有效地