实验一革兰氏染色细菌接种.ppt

实验一 革兰氏染色、细菌接种,实验内容,一，革兰氏染色（操作） 二，细菌接种 平板划线法（操作） 斜面培养基接种法（操作） 半固体培养基接种法/穿刺接种法（操作） 液体培养基接种法（操作） 细菌在液体、固体、半固体培养基中的生长现象（示教）,实验内容,一，革兰氏染色（操作） 二，细菌接种 平板划线法（操作） 斜面培养基接种法（操作） 半固体培养基接种法/穿刺接种法（操作） 液体培养基接种法（操作） 细菌在液体、固体、半固体培养基中的生长现象（示教）,革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gran 创立的。,实验原理：细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。,Structure of a Gram-Negative Cell Wall Structure of a Gram-Positive Cell Wall,经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。,Gram negative,Gram positive,涂片： 将杆菌和球菌分别涂片、干燥、固定。 革兰氏染色： 初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗 媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗 脱色：将水甩净，并衬以白背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约2030秒，立即用水冲净乙醇 复染：用番红液染1-2分钟，水洗,涂片：,思考题,作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？ 其染色成败的关键步骤是什么？ 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？ 造成革兰氏染色结果不正确（假阴性或假阳性）的主要原因有哪些？,实验内容,一，革兰氏染色（操作） 二，细菌接种 平板划线法（操作） 斜面培养基接种法（操作） 半固体培养基接种法/穿刺接种法（操作） 液体培养基接种法（操作） 细菌在液体、固体、半固体培养基中的生长现象（示教）,细菌生长繁殖的条件,充足的营养物质 水，碳源，氮源，无机盐，生长因子 合适的外界环境 温度 酸碱度 气体 渗透压,培养基,适合于细菌生长繁殖需要的各种营养物质在PH(7.27.6)条件下配制而成的基质。 培养基配成后灭菌,培养基分类,（按物理性状分） 液体培养基 半固体培养基 （含0.10.5%琼脂） 观察穿刺线、保存菌种 固体培养基 （含23%琼脂） 平板：划线分离，菌落计数，分离纯化 斜面：纯种移种,培养基分类,（按营养成分分类） 基础培养基 含细菌菌生长的基本营养成份 营养培养基 加入糖，血，血清，酵母浸膏等 ，用于营养要求高的细菌的培养，如：血平板,培养基分类,（按用途分） 合成培养基 用于研究细菌代谢过程、特殊菌的分离培养 鉴别培养基 含有特定的作用底物，如糖发酵管，葡萄糖蛋白胨水 选择培养基 在培养基中加入抑制某些细菌生长的物质，而选择性地允许另外一些细菌的生长。如肠道致病菌选择培养基：SS培养基，抗生素培养基 厌氧培养基 庖肉培养基,一，平板划线法（操作）,平板分区划线,平板分区划线,平板划线法,是一种分离培养法,接种,培养,长出单个菌落,实验步骤（平板划线法）,不要说话，严格无菌操作 灼烧接种环后要冷却 取一环葡萄球菌或大肠杆菌 划线时用腕力，不要使接种环嵌入琼脂 各个分区要分明 在培养皿底部贴标签 倒置培养以防止结晶水冲散细菌,二，斜面培养基接种法（操作）,斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞,实验步骤（斜面接种法）,用左手握住菌种管（葡萄球菌或大肠杆菌）和斜面培养基管，右手持接种环。 用右手小指与手掌、小指与无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰灭菌。 用接种环或接种针伸入菌种管内，挑取用来接种的菌苔。 伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线。 接种完成之后，用火焰灭菌培养管口，并塞上棉塞，置于37培养。,三，半固体培养基接种法/ 穿刺接种法（操作）,穿刺接种法,实验步骤（穿刺接种法）,用左手握住菌种管（大肠杆菌或痢疾杆菌）和半固体培养管，右手持接种针。 用右手小指与手掌、小指与无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰灭菌几次。 用接种针伸入菌种管内，挑取用来接种的菌苔。 垂直刺入半固体中心，至近管底部，然后沿穿刺线退出。 塞回棉塞，接种针重新灭菌。接种完毕，于37培养1824h，观察生长情况。,四，液体培养基接种法（操作）,实验步骤（液体培养基接种法）,用灭菌接种环挑取用来接种的菌苔。 菌种管：葡萄球菌/大肠埃希菌/痢疾杆菌 在试管内壁与液面交