《固定化酶》PPT课件-2.ppt

,第九章 固定化酶,固 定 化 酶,是酶工程研究中的一个重要领域 9.1 什么是固定化酶 固定化酶被确定下来是在1971年第一届国际酶工程会议上提出并确定。固定化酶是设计一种方法，使酶被束缚在特殊的载体上，使它与整体流动相分隔开，但还是能进行底物与效应物等分子交换，底物释放。 可看成一般化学反应中的固体催化剂, 但又赋予酶的催化特性。,第九章 固定化酶,9.2 固定化酶的优点 溶液性酶的缺点： 1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、 有机溶剂对其有影响）， 2.不能回收,无法自动化、连续化生产， 3.专一性高。 固定化酶优点： 1.可以提高稳定性 2.能回收，自动化，连续化 3.专一性减弱 4.提高抗有机溶剂的能力,第九章 固定化酶,一种容易回收，反复使用，成为可连续化、自动化的水不溶性酶，就称固定化酶(或：水不溶酶)。 固定化酶现在的发展是，固定的对象不一定全是酶，可以是细胞或细胞器、菌体。 统称为固定化催化剂。,第九章 固定化酶,9.3 固定化方法： 固定化方法 吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法 物理 离子交 固定化 偶联 吸附法 换吸附 载体 反应 格型包埋 微囊包埋 现有多孔物质包络法，超过滤法等。实际上用包埋法最多,第九章 固定化酶,各种固定化方法的优、缺点比较 吸附法 固定化方法 物理吸附法 离子吸附法 包埋法 共价键结合法 交联法 制备难易 易 易 较难 难 较难 结合程度 弱 中等 强 强 强 活力回收 高,酶易流失 高 高 低 中等 再生 可能 可能 不能 不能 不能 费用 低 低 低 高 中等 底物专一性 不变 不变 不变 可变 可变,第九章 固定化酶,吸附法 物理吸附(氢键、疏水键等作用力将酶固定 于不溶性载体上) 无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化 铝等)吸附量小、有些酶发生吸附变性 有机吸附剂（纤维素、胶原等）吸附量略 大(50mg/g载体),不产生变性失活， 比较受重视。 有些微生物分泌胶水一样的粘多糖，使微生物与固体物质固定化。,第九章 固定化酶,第九章 固定化酶,离子交换法： 在合适条件下（pH、离子强度），酶的侧链与载体发生离子交换的作用而达到的固定化，CM-纤维素、DEAE-纤维素，吸附量 50150mg/g 优点： 操作方便，条件温和，可再生 缺点： 吸附弱，不适宜的pH，高盐浓度，高底物浓度，高温等都能把吸附的酶解吸下来。,第九章 固定化酶,现在经过改进和改善的方法： 1.选择最佳条件操作（如温度、 pH）， 2.选吸附量大的载体，控制酶和载 体量， 3.采用高酶量吸附； 4.开发新载体， 5.对酶进行修饰后再进行交换吸附。,第九章 固定化酶,如DEAE-纤维素吸附-淀粉酶，蔗 糖酶， DEAE-纤维素不一定氨基酸酰化酶 如开发出：N-烃基琼脂糖衍生物 吸附黄嘌呤氧化酶，脲酶等酸性pH的酶专一吸附糖蛋白，而且非常牢固。借助静电力和疏水键吸附。,第九章 固定化酶,制备亲和吸附剂，如 ConA-葡聚糖用 来吸附蛇毒核酸酶 如：对酶进行修饰后再与载体结合，胰蛋白酶+丙烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚体共价偶联，再加DEAE-纤维素结合。 结果：结合力增大(吸附大)，相当稳定，使用寿命长，有时可连续使用3个星期。,第九章 固定化酶,多孔物质包络法： 利用棉布、尼龙布、金属丝网、海绵、塑料等固定化放线菌、真菌组成盘状生物反应器，进行连续生产有机酸、糖化酶、四环素。 这些材料足够大而空隙又不大，能使细胞进入空隙，常为细胞直径的数倍大。 超过滤法： 利用超过滤膜将细胞固定化。底物和产物可自由进出超过滤膜，而膜内细胞却出不来。如膜反应器和生物传感器。但需防细胞生长使用浓度过高而使膜破裂。,第九章 固定化酶,第九章 固定化酶,吸附方法： 1.静态吸附（自然吸附、解吸、再吸附） 效率低，时间长且不完全。 2.电沉积（在载体附近加电极，酶移向载 体表面）。需酶在电场中不破坏，保 持原来酶性能。 3.动力法固定化（酶与载体混合后搅拌等） 注意速度，不破坏酶和载体。 4.反应器固定化（载体装入反应器后循环 加入酶液）。但吸附少，不适合的条件（pH、盐等）容易解吸。 要注意条件，开发更有效的新的吸附剂。,共价偶联： 通过载体的功能基团与酶侧链基团上非必需基团共价结合，制备成的固体酶的方法。优点：应用最广，固定化结合牢、稳定而酶不丢失，可以连续使用。,第九章 固定化酶,1载体要求： 亲水载体优于疏水载体（酶蛋白结合量，固定化后酶活性，稳定性方面）， 而亲水基存在可减少疏水基的有害影响。 载体特点： 1.结构松 2.表面积大 3.机械强度大 4.带有在温和条件下可与酶侧链基团共 价偶联的功能基团 5.没有或很少有非专一性吸附,第九章 固定化酶,一般与亲和层析所需载体要求、标准一致 如:天然纤维素或衍生物 葡聚糖凝胶 亲和性好,机械性能差 琼脂糖 合成的： 聚丙烯酰胺 多聚氨基酸 机械性能好但有疏水结构 聚苯乙烯，尼龙,第九章 固定化酶,2偶联方法： 偶联成功与否取决于： 载体：功能基团，芳香氨基，羧基，羧 甲基等 酶分子:侧链非必需基团 （游离-氨基，lysNH2, Arg-胍基，-COOH, Asp-羧基 Glu-羧基，酚羧基，巯基，咪唑基) 但是，载体、酶分子上的基团是不能直接反应，功能基团要活化，,第九章 固定化酶,1)重氮化 芳香氨基载体 方法特点： 载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，在温和条件和酶分子上相应基团直接偶联。 芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入分子中Tyr等集中的疏水区偶联而导致失效。 a.当载体为电中性或疏水性时，这种倾向 性越大。 b.当载体用亲水极性物质时，这种疏水区 的特性就大大减小了。,第九章 固定化酶,如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，偶联到重氮化的电中性载体（对氨基苄基纤维素），产生固定化酶无活性。 偶联到重氮化的苯胺-多孔玻璃时， 得到固化酶都具很高酶活性。,第九章 固定化酶,第九章 固定化酶,2） 异硫氰酸反应 含芳香氨基载体先用硫芥子（或光气） 处理成异硫氰酸盐衍生物，再在温和条 件下，优先与酶的氨基反应，在中性pH 下优先与-氨基反应，可达到选择性 偶联的目的。,第九章 固定化酶,3） 溴化氰-亚氨碳酸基反应 带羟基载体纤维素、葡聚糖、琼脂糖等是最常用载体。在碱性条件下载体的-OH和溴化氰反应成活泼亚氨碳酸基，在弱碱中直接和酶的氨基偶联。 最后一种是主要产物。,第九章 固定化酶,此法是BrCN活化后的固定化，操作 是方便，但是活化比较麻烦，安全问题， 需要非常小心。 固定化后酶活力相对比较高，且相当稳定。 是受欢迎的一种方法,第九章 固定化酶,4) 芳香烃化反应： 含羟基的载体在碱性条件下和三氯 三嗪等反应，引入卤素后直接与酶的氨 基、酚羟基或者巯基等偶联。 优点： 1产物带正电符有利于中性或碱性酶偶联 2）可与所有亲核基反应 3）少选择性,5）叠氮反应 适用于羟基，羧基，羧甲基等载体 如羧甲基纤维素或葡聚糖、聚氨基酸等。 羧甲基纤维素为例： 在酸性条件下用甲醇脂化 再用水合肼处理成酰肼后在亚硝酸作用下变成叠N衍生物， 在低温、pH7.58.5间与酶的氨基直接偶联，也可和羟基、酚羟基、巯基反应,第九章 固定化酶,第九章 固定化酶,6）酰氯酰化反应： 含羧基载体（如羧酸树脂）通过氯化亚砜处理成活泼的酰氯衍生物，再与酶偶联。 -COOH(羧基载体)+SOCl2 (氯化亚砜） -COCl（酰氯衍生物）+ NH2-E CONH-E,第九章 固定化酶,7） 酸酐反应 乙烯等和顺丁烯二酸酐的共聚 物，通过其活泼酸酐基直接与酶氨 基偶联。生成的固定化酶一般有比 较高的活力。,第九章 固定化酶,8） 缩合反应 利用羰二亚胺活化使氨基、羧基直 接偶联，缩合为肽键的反应。载体成为活 泼的酰基异胍衍生物。 带羧基载体与环二已基二亚胺(DCCI) 存在时，用N-羟基琥珀酰亚胺活化，在温 和条件下与酶的氨基反应,缩合反应控制 pH6。反应限于氨基。,第九章 固定化酶,9)巯基-二硫基交换反应。 巯基或二硫基载体通过巯基-二硫基交换反应和酶上非必需巯基偶联。功能基团为巯基先用2,2吡啶二硫化物处理，变成二硫基，生成中间物在酸性条件下与酶的巯基发生交换而偶联。化合物在酸性条件下发生交换。在大量巯基化合物存在条件下逆转为载体和巯基酶。 制备成亲和层析柱，酶得到纯化。,第九章 固定化酶,10)金属偶联反应 一些过渡态金属能使纤维素、尼龙、滤纸、酵母细胞等直接转化成固定化的载体。 方法：将这些材料浸入金属溶液中，过滤、洗涤加酶而成。常用金属有钛、锡、锌、铁等氯化物。 其机制还不清楚。 NH2-酶 -OH+金属氯化物 -O-MCl- -O-M-NH 酶 (锡、锌)MCl2,第九章 固定化酶,固定化酶制备成功的关键： 1.需选择好载体和固定化方法。 2.控制固定化条件，不要太强烈。 3.把活性中心的必需基团保护起来，用可逆抑制 剂或者底物。 4.偶联的酶非常重要，就是偶联酶量。知 道“相对酶活力”，固定化酶前后的 活力差异。 与载体材料、固定化方法、条件、酶反应系 统的组成都有关系。 如果把上面提到的条件固定，那么偶联酶量就成为主要解决的问题。,第九章 固定化酶,第九章 固定化酶,偶联反应中的保护措施。 化学反应一般较剧烈，为了减少酶损失，可采取如下措施： 1.采用适宜的固定化材料和方法。如重氮 化注意载体的亲水性和疏水性。 2.严格控制反应条件，提高反应专一性。 如与-氨基反应，保护其他氨基。 3.用抑制剂或底物保护酶活性中心和必需 基团避免影响酶活性构型和基团。 酶的偶联量: 单位载体上偶联酶的总量与“相对酶 活力”间的平衡。,相对酶活力： 指固定化酶和蛋白量与相等原酶的活力比。 因固定化时受载体、方法、条件、酶反应系统的影响，即使以上因素一定，还会受到酶偶联量的影响。 1.只有达到一定的偶联量，酶活性达到最高 2.达一定偶联量，酶过多或者集中于载体局 部造 成空间位阻，部分酶无法表现活 性。 随酶偶联量上升酶活性反而下降。 寻找二者平衡点使酶活性达到最高。,第九章 固定化酶,交联法： 利用双功能或多功能试剂在酶分子间或载体间；酶分子与载体间进行交联反应而达到固定化。通常用戊二醛,第九章 固定化酶,OHC-(CH2)3-CHO+E-CH=N-EN=CH-(CH2)3-CH=N-E-+CH- N N CH CH 同型的：戊二醛，最常用 异型的：甲苯-2-异氰-4-异硫氰： 交联的特点： 酶浓度低，交联发生在分子内，呈液态状。 酶浓度高，交联发生在分子间，固定化后 酶与载体成为不溶态颗粒。 缺点： 固定化后，往往颗粒小，机械性能差。,第九章 固定化酶,克服的方法： 1.酶先吸附在载体上或包埋在胶内、微囊 内，再交联或固定成酶膜或酶网颗粒 2.酶先在硫酸胺或者丙酮中沉淀，再交联。,第九章 固定化酶,实验方法上掌握要点： 1) 交联条件激烈，需要保护酶的措施。 2) 交联剂的链长和功能基团的选择问题。 只要选择适当，有利于建立某些分子 内交联，亚基固定和四级结构维持，可以 增加酶的稳定性。但链过长后疏水性上升， 疏水性升高对固定化酶不利。,第九章 固定化酶,包埋法： 将聚合物单体和酶液混合后，用聚 合促进剂(包括交联剂)作用而聚合，酶 就包埋在载体中达到固定化。,第九章 固定化酶,酶本身不参与反应，所以较安全，但在聚合中有自由基产生及聚合时放出热，酶与试剂间可能发生化学反应，这些因素可能会使酶失效，或降低酶活性。 操作时注意条件的控制。,1）格型包埋 常用包埋剂：聚丙烯酰胺凝胶。 先把酶与丙烯酰胺单体分散于疏水介质,再用交联剂和促进剂进行聚合。 优点: 1.包埋容量10100毫克蛋白/g单体。 2.改变单体与交联剂比例,控制凝胶孔径大 小, 改善酶的持留与底物和产物扩散 转移状况。 3.改变单体性质,可调整固定化酶的亲水和 亲脂特性。,第九章 固定化酶,1）格型包埋 缺点: 1.孔径过大,有酶的丢失现象,这时可提 高单体浓度 达到部分解决。 2.单体15%,丙烯酰胺自身会导致酶 失活。可用包埋和共价偶联结合。 3.有自由基产生，聚合时会放热，,第九章 固定化酶,例子： 如葡萄糖-6-Pi脱氢酶 包埋于丙烯酰胺和丙烯酸中， 再用羰二亚胺活化载体上的羧基而共价偶联固定。,第九章 固定化酶,2)微囊型包埋 常用微囊型包埋剂有尼龙膜、火棉胶、 醋酸纤维素等。 用半透膜将酶包埋在里面， 半透膜容许底物和产物自由出入膜囊， 囊的表面积相对体积的比值大， 底物和产物的交换进行迅速。,第九章 固定化酶,第九章 固定化酶,例子：尼龙膜界面聚合包埋 (酶+己二胺水溶液)+庚二酰氯有机溶剂(氯仿) 混合 乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯) 在水相、有机相交界处聚合 形成包埋酶的尼龙膜珠粒 Tween 20破乳化,得到微囊包埋酶,界面凝聚法： 硝酸纤维素:高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极度下降而凝固、聚合形成皮膜将酶固定化。 酶水溶液 + 硝酸纤维素 乳化分散,加苯甲酸丁酯使纤维素在酶周围凝聚， Tween 20乳化后得到火棉胶微囊。 如蔗糖酶可以达到1500mg/g聚合物 优点： 1）纤维表面积和重量比值高 2) 凝聚后酶稳定性好 3) 包埋量大,第九章 固定化酶,3)脂质体包埋 如：胆碱-Ser + 卵磷脂胆固醇 一定比例混合 直接喷入酶液或在瓶壁形成膜再加酶液 二相迅速混合时自然地形成脂质体表面。 优点： 1.具有一定强度 2.可专一性地将酶带到体内特定部位， 再释放酶 3.脂质体可和某些如抗体结合赋予定向 运转的功能,第九章 固定化酶,主要利用脂质体的双层结构，把酶包埋 在脂质体微囊中。相对一般的包埋方法， 在数量和方法上没有太多优势。 现在，大量的脂质体包埋方法是包埋药 物，成为一种给药途径，可以制备成定向 性的缓慢释放药物，提高药物有效性。,第九章 固定化酶,定向固定化问题: 由于非定向固定化使得酶活性部分或者全部失去活性。这是底物与酶的取向不适合以前。,第九章 固定化酶,如何进行定向固定化？ 1. 共价固定法 酶分子表面有很多可供固定基团。选择性地利用酶分子表面远离活性位点的稀有基团(如疏基)进行反应，使该基团与载体上另一基团共价交联来固定酶蛋白。 目的：使其活性中心朝向溶液方向，以达到控制其空间取向的目的。,第九章 固定化酶,有人用一个异双功能试剂进行研究 通过三种方式与巯基光诱导交联: 1.直接由马来酰亚胺与巯基反应， 并向目的分子引入一个碳烯; 2.与巯基通过光化学反应交联; 3.化学修饰后与巯基反应，并向 目的分子引人一个碳烯。,第九章 固定化酶,# 共价固定需要蛋白质分子表 面有特异的基团供反应，该 基团必须远离活性中心,第九章 固定化酶,氨基酸置换法 利用基因定点突变技术在分子表 面合适位置上置换一个aa，通过该aa 残基特殊的侧链基团控制固定方向。 Cys为低频aa，在酶分子中出现频率 约2%，其巯基可与载体的碘乙酰基团 发生烷基化。 Cys还能与金属表面牢 固结合，在二氢叶酸还原酶 C端引人 后，在金属表面固定的酶量比野生型 酶高4倍。,第九章 固定化酶,Huang等在枯草蛋白酶分子表面远离活性中心的位置通过定点突变引入Cys残基。经蛋白质空间折叠后暴露出Cys，再用Cys残基上的疏基固定枯草蛋白酶分子，取得很好固定效果。 固定效率和催化活性有很大提高。 特异固定Kcat、Km的值是随机固定的3.4倍， 非特异性吸附小于1%， 固定化酶在4条件下25天保持原活性61%，室温下25天保持原活性28%， 而室温下非固定化酶25天仅保持活性12%。,第九章 固定化酶,定点突变用于定向固定化要求对蛋白质的核酸序列及空间结构有充分了解，蛋白质分子表面不含所要引入的氨基酸残基，而且引入的氨基酸不影响蛋白质分子的正常空间折叠及构象改变。 抗体偶联法： 基因工程单链抗体:在基因水平上融合抗体轻链可变区形成具有抗原结合活性最小长度肽链。理论上用抗体库技术可筛选任意物质的抗体。,第九章 固定化酶,蛋白A分子是金黄色葡萄球菌的胞壁成分(单一肽链)分子中有四个高亲和力结合免疫球蛋白分子片段的位点，己有重组产品问世。 蛋白A有较高的热稳定性，变性剂存在时仍能保持天然构象。,第九章 固定化酶,第九章 固定化酶,生物素一亲和素亲合法 生物素存在于所有活细胞内，但含量甚微(0.0001%)的中性小分子辅酶。 亲和素是个含四个相同亚基的四聚体，每亚基含一个生物素结合位点(解离常数1O-5mol/L)。,第九章 固定化酶,生物素与亲和素或相应细菌中的链霉亲和素高度专一、极强的亲和力。极端pH、高离子强度、或促溶剂都不破坏这种结合。这种特性使其成为免疫分析、受体研究、免疫组织化学、基因工程和蛋白质分离等领城中独特有力的工具。,将生物素羧化载体蛋白片段分别融合在荧光素酶和氧化还原酶的N末端，然后将这两个融合蛋白(BCCP-荧光素酶，BCCP-氧化还原酶)定向固定在亲和素包被的琼脂颗粒上。荧光活性提高了8倍，固定化酶的稳定性和固定效率均大大提高。 在E.Coli碱性磷酸酶C末端(活性中心)远瑞接一供体分子(链霉肽)形成融合蛋白，通过供体与载体上受体的特异性结合而使酶分子按一定的空间取向固定在载体上。,第九章 固定化酶,又通过插入链霉肽与酶分子间的一小段亲水肽作为连接臂，增加酶分子与载体间的距离，减小了空间位阻。保持酶分子的活性构型。 固定后融合蛋白的回收活力是不加连接臂同样酶蛋白的8.4倍。 与化学修饰法和aa置换法相比，融合蛋白法有如下特点: 反应温和，不会对酶原结构和功能产生影响;且易于控制酶蛋白的空间取向。,第九章 固定化酶,5 疏水定向固定法 细胞粘着分子：介导细胞-细胞、细胞-底物粘着、细胞发育和细胞信号发生的分子。 疏水定向固定：保持酶分子结构、生理活性及天然构象。通过疏水作用的固定，固定效率高，为非共价，且固定过程可逆，用去污剂可终止或消除固定反应。,第九章 固定化酶,以上介绍酶蛋白的定向固定方法，仅提供一些思路。 实验中采取何种方法主要根据实验的目的和实验条件。 但是，总起来说，其方法和理论有待进一步发展和成熟。,第九章 固定化酶,辅酶以及偶联酶系的固定化 辅酶固定化的特点： 1.与酶蛋白有亲和性； 2.酶蛋白需辅酶才具有酶的最大活性 3.辅酶有弱的酶活性,一旦结合酶活性大增 辅酶固定化一般采用共价偶联法。 如：磷酸吡哆醛固定化是功能基团， 有三种方式与载体结合，功能基团处于游离状态需辅酶物质的酶固定化,第九章 固定化酶,辅酶与酶蛋白的亲和性进行固定 Trpase（酪氨酸酶）有四个亚基，四个活性中心，需磷酸吡哆醛,但是结合弱,容易解离,用K离子促进结合。 磷酸吡哆醛偶联于琼脂 糖上-利用吡哆醛四位 甲基与酶蛋白的-NH2 结合,形成Schiff固定化。 可以制备成酶-辅酶络 合物，酶活力较高。 由于辅酶与酶蛋白结合后，很弱，固定化后常需要加些辅酶，以补充不足。,第九章 固定化酶,9.5 固定化细胞 固定化细胞今后会超过固定化酶的发展 原因: 1. 降低成本; 2. 固定化细胞比固定化酶简便; 3. 可作为单一酶使用，也可作复合酶系完 成部分代谢和发酵过程。,第九章 固定化酶,9.5 固定化细胞 方法： a)直接固定化-利用热、冰冻等手段固定 化（如加柠檬酸、凝剂等）。 1使菌体内的蛋白酶变性，保护所需酶 2使菌体内酶固定住，防止损失或损 3颗粒增大防止酶损失,第九章 固定化酶,第九章 固定化酶,如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌),是胞内酶 5080，10分钟 ( 使菌体自溶的酶失活，而葡萄糖异构酶仍保持活性，长期使用酶活力不减少)。 有直接用霉菌孢子固定化，或用双功能试剂将同源和异源的酶固定于菌体的细胞壁上。 如把淀粉葡萄糖苷酶偶联于含葡萄糖异构酶的链霉菌上去。用菌体直接“联合”加工淀粉成为果糖。,除上面直接固定化外，其他方法 a) 吸附方法 b) 包埋方法 c) 交联，共价偶联方法,第九章 固定化酶,第九章 固定化酶,固定化例子： 酒石酸产生菌固定化,无水马来酸酐,顺式环氧琥珀酸,富马酸,有生产厂家用1吨固定化细菌体 （约80公斤棒状杆菌)， 生产10吨L(+)酒石酸 好的时候1213吨L(+)酒石酸,第九章 固定化酶,做固定化菌体时，注意问题： 1。固定化的细菌的酶活性一定要高。 2。要有一个简便的酶活性测定方法。 顺式环氧琥珀酸水解酶测定： a. 定量点样，纸层析后，喷显色剂 的颜色深浅,与标准比较 b. 红外光谱法 c. 苯胺法,与标准曲线比较而得,有干扰 d. 旋光法,与标准品对照而得,温度干扰 e. 偏矾酸胺法，与标准曲线比较得到,第九章 固定化酶,做固定化菌体时，注意问题： 活力单位： 1g细菌或相当于1g细菌的固定化细菌在pH8，1mol/L顺式环氧琥珀酸盐20ml,37,150转摇动反应1小时，取样A480nm测定。 转化液含的酒石酸 X 106 U= - 150.4 X 1 X 1 umol/h.g,第九章 固定化酶,4.8%的卡拉胶（或明胶、海藻酸钠） （1:1 / 卡拉胶:菌体） 60 溶解，转到42 水浴保温 作好等体积的16%浓度的 细菌， 42 水预先保温 然后混合搅拌均匀 4 放置30分钟，取出，切成 4x4x4mm的小颗粒。 工业化规模的制备固定化细菌 有机器来做。,第九章 固定化酶,第九章 固定化酶,固定化小颗粒 多乙烯多胺浓度1.25%，作用10min; 渗透交联 戊二醛浓度0.75%，作用30min后，水洗 去没有作用的多乙烯多胺和戊二醛 作用硬化 包埋与交联结合的固定化 包埋与渗透交联的固定化 作用： 固定顺式环氧琥珀酸水解酶产生菌细胞，利用固定化细胞胞内酶转化顺式环氧琥珀酸盐生产L(+)酒石酸,第九章 固定化酶,结果： 1.渗透交联后，固定化颗粒是不渗 透交联液态酶活性提高23倍。 2.渗透交联固定化酶活:固定化不渗透交联 =5:1多。 3.反应时间缩短，保存期也有提高。 4.连续作用几十批次，酶还有相当 活性。 4 放置40天，相对酶活性几乎不变化。,第九章 固定化酶,做一个固定化实验： 1. 采用什么固定化方法？(参考和直接实验做) 2. 用什么固定化载体？ （卡拉胶、明胶、海藻酸钠、琼脂） 3. 定了载体卡拉胶，选择载体浓度？1.7% 4. 细菌浓度？8% 5. 交联剂选择（戊二醛或其他） 6. 选择交联剂浓度？0.5% 7. 作用时间？15min 8. 渗透剂（多乙烯多胺、己二胺、吐温？） 9 选择多乙烯多胺浓度？ 1.25% 10 作用时间？30min 11. 固定化菌体作用的最适pH？pH8.0 12、13 作用温度?37 42 ;底物浓度?0.8mol/L,第九章 固定化酶,温度稳定性大大提高,pH稳定性提高,第九章 固定化酶,96 固定化酶的性质： 由于受固定化酶本身和反应环境影响，酶活性和反应系统都会有影响。 其影响十分复杂，一般低于溶液酶。 （但有例外） 主要原因： 1.构象改变：与固定化过程有关， 与载体性质有关， 或者两者都有关。,第九章 固定化酶,96 固定化酶的性质： 构象改变： 主要指活性中心的构象改变导致的活性降低，但从实验可以知道这些情况在吸附和共价偶联方法中出现。,第九章 固定化酶,2立体屏障： 指载体孔径太小， 或固定化方法引起位置不当， 使酶活性中心或调节中心造成空间障碍， 酶和底物无法接触反应。 这种情况无法定量，也无法预测。 使用大孔径胶， 或用吸附和共价偶联法把酶固定于 纤维素一类载体上，或在酶和载体间 加“臂“，情况可以改变。,第九章 固定化酶,3微扰： 指载体本身的亲水、疏水性质和介质解电常数等的影响，使酶的作用能力及酶对效应物作出的反应能力发生的效应。 结果：很难预测，只能通过改变载体与介质的性质做出判断和加以调节,第九章 固定化酶,4分配效应和扩散限制 两种效应都与固定化后的微环境有关。 微环境： 指与固定化酶紧邻的微观的局部环境。 它与宏观体系不同，只是由于固定化以后产生的一个新概念。,第九章 固定化酶,Nernst层：包围在固定化颗粒周围几乎停 顿状态的溶液液膜层。 微环境：固定化颗粒内所处的环境 宏观体系：颗粒与颗粒周围所有溶液组成 的一个大系统。,第九章 固定化酶,分配效应： 是固定化载体亲水、疏水性质对 酶、底物、产物等效应物在微环境和 宏观体系间发生不等分配， 从而改变酶反应系统组成的平衡， 而最终影响酶反应速度的一种效应。,第九章 固定化酶,一般规律是： 1)如载体、底物(效应物)都带相同电荷， 反应体系的Km因固定化而增大 相反电荷，那么Km因固定化而减少。 2)载体带正电荷固定化后向酸性(左)移， 载体带负电荷固定化后向硷性(右)移。 这种效应通过调节离子强度减弱而消除 3)采用疏水载体，底物是极性的，Km固 定化后会升高，效应物也是。 采用疏水载体时，底物是疏水的， Km固定化后会降低。,第九章 固定化酶,一般规律： 实际速度由底物、产物的转移速度和酶催化速度的共同决定。且由慢的速度那个决定。 扩散限制可以看成是抑制效应。 1）其扩散限制效应对反应速度影响取决 于效应本身大小，取决于原来酶反 应速度的相对大小； 原反应速度小，扩散限制影响也小； 原反应速度大，扩散限制影响也大。 2）外扩散可通过搅拌与混合减轻或 消除,第九章 固定化酶,扩散限制: 指底物、产物、效应物从