实验动物学第十章动物实验设计与结果分析.ppt

,1,第十章 动物实验设计与结果分析,第一节 动物实验设计 第二节 动物实验准备与预实验 第三节 动物实验数据收集与处理 第四节 动物实验结果分析及应注意的问题 第五节 动物实验研究的局限性,2,生物医学实验研究可分为整体水平、器官水平、细胞水平、亚细胞水平、分子水平等层次研究，一个课题可以仅在一个水平层次进行研究，但更多的是多个水平层次的综合研究。动物实验研究是以整体水平层次为主的研究。 正确地选题立项： 目的性 科学性 创造性 可行性,第一节 动物实验设计,3,一、动物实验设计的定义 动物实验设计是指研究者根据实验目的和要求，运用有关科学知识和原理，结合统计分析及伦理学的要求而制定的在动物身上进行试验的实施计划和方案，并用文字记录或流程图表述的实验方案和技术路线。 动物实验的结果能否取得预期效果、达到研究目的很大程度上取决于研究者动物实验设计是否科学、严密。,4,根据研究课题和目标的不同，动物实验设计可以很庞大、复杂，也可以很小、很简单。 绝大部分研究课题需要研究者进行动物实验设计。 一些测试、检验等的动物实验方法已经被大家公认成为常规，不需要进行动物实验设计。,5,动物实验设计包括三个基本要素： 处理因素 处理因素是实验中需进行重点考察的内容，处理因素不同，实验结果也不同。在整个实验中处理因素应标准化，否则会影响实验结果的评价。在一次实验中处理因素不宜过多，过多则增加分析的难度。 受试对象 在动物实验中，受试对象是实验动物。根据研究课题不同，选择适合本课题研究的动物的种属、品种品系、年龄、性别（体重）等，确定分组情况、每组的样本量和受试对象总数。在一般情况下，应优先使用标准化实验动物以保证动物实验的质量。 实验效应 实验效应是指处理因素作用于受试对象后所起的作用，它通过观察指标来实现。观察指标分为主观指标和客观指标。为保证实验数据的可靠性和可比性，在选择指标时应尽可能选择客观指标，或尽可能将主观指标转化成客观指标，并要求有一定的灵敏度和精确性。,6,二、动物实验设计原则 （一）对照性原则 对照性原则是要求在实验中设立可与实验组比较，用以消除各种无关因素影响的对照组。 对照应有可比性：同时同地同条件 一个完整实验除了实验组外，还应包括下列对照组，所有动物应根据随机原则分配到各组内。 阴性对照组 阴性对照组包括空白对照组、正常对照组和假手术组，需要根据实验的具体情况设置 阳性对照组 阳性对照组是用已知的能达到预期阳性试验结果的处理因素作用于动物，其余非处理因素应与其它组一致。 阳性对照组有2个作用，一是检验试验体系是否正确，如果阳性对照未出现阳性结果，就应该检查试验体系的哪个环节出现问题；二是以阳性对照作为参照物，比较和评价实验组的阳性结果是高于还是低于阳性对照。 实验对照组（模型对照组） 实验对照组是指在研究过程中，给对照组施加部分处理因素，但不是被研究的处理因素。例如：为了研究某种药物对某一病种或证型的治疗作用，常常采用一定的动物模型。对动物模型的处理方法实验治疗组和实验对照组完全相同，但是治疗组给予药物，而实验对照组不给药物。,7, 标准对照组 在以动物为实验对照组时，常设立一个不造模处理的正常对照组，即标准对照组，在与实验组和治疗组同样的条件和环境中完全按常规饲养。例如在老年病研究中，除了设立老年对照组外，还需设立一个青年对照组。青年对照组的动物种类、性别与老年对照组和治疗组相同，只是月龄小（成年）。在这里，青年对照组相当于标准对照组，其实验数据对于老年对照组（模型对照组）而言，相当于标准值或正常值。 有的实验还可设自身对照。 同一个体身上观察实验处理前后某种指标的变化 同一动物在施加实验因素的一侧与不施加实验因素的另一侧作左右的对照。 自体对照可有效减少个体差异对试验处理反应的影响。凡可进行自身对照设计的实验应尽量加以采用。 在药理学和毒理学试验中，实验组还进一步分成多个剂量组，以此观察不同剂量的量效关系。不同剂量组也可互视为剂量对照组。,8,(二)随机性原则 随机性原则就是按照机遇均等的原则来进行分组。其目的是使一切干扰因素造成的实验误差尽量减少，而不受实验者主观因素或其他偏性误差的影响。 随机化的手段可采用编号卡片抽签法，随机数字表或采用计算器的随机数字键。 （三）重复性原则 重复性原则是指同一处理要设置多个样本数。 重复的主要作用是估计试验误差、降低试验误差和增强代表性，提高实验结果的精确度，保证实验结果能在同一个体或不同个体中稳定地重复出来。,9,（四）一致性原则 一致性原则是指在实验中实验组与对照组除了处理因素不同外，非处理因素基本保证均衡一致。均衡一致是处理因素具有可比性的基础。 非处理因素： 实验对象：动物品系、体重、年龄、性别、 实验条件：饲料和饲养方式、 实验环境：实验室温度、湿度、气压、季节 实验时间： 药品：药物厂商、批号、纯度、剂型、剂量、注射容量和速度、酸碱度、温度、给药途径和给药顺序 仪器、设备：仪器种类、型号、灵敏度、精确度、零点漂移、电压稳定性 操作人员：操作步骤熟练程度,10,(五)客观性原则 动物实验设计中要力戒主观偏性干扰，选择观察指标时，不用或尽量少用带主观成分的指标。结果判断要客观，更不能以主观的意愿对结果或数据作任意的改动和取舍。 如中医辨证“气虚”症状为面色晃白，头晕目眩，少气懒言，神疲乏力，甚则晕厥。在大小鼠辩证中可用自发活动仪记录小鼠的自发活动情况、舌苔颜色可用拍照和与标准色卡对比记录，并与正常对照组比较。,11,三、动物实验设计的主要内容 （一）动物实验设计前应考虑的问题 1动物福利和动物实验伦理问题 在进行动物实验设计前，实验者必须思考： 这个实验是否一定要用动物才能达到实验目的？是否可用其它试验方法来代替？ 如果实验必须要在动物身上进行，那么应该如何善待动物，在实验中减轻动物的痛苦和不安？ 实验者必须提出令人信服的理由证明这个实验必须要用动物做，而且在实验设计中采取了善待动物和减轻动物痛苦的具体措施，并承诺本动物实验方法和目的符合人类的道德伦理标准和国际惯例，在动物试验期间遵守有关的法规、实验动物伦理福利原则和动物实验室的规章制度。,12,2实验条件问题 实验者必须了解进行本实验的所有条件是否均已具备，如相应的动物设施、动物来源、仪器设备、试剂、人员、技术熟练程度等，这些实验条件的描述将充分体现在实验方案中。 3经费预算问题 动物实验是需要经费支持的，一般来说，同一课题经费不同，所选择的实验条件会不同，研究的层次也会不同。本着节约经费的原则，有多少经费做多少事情，量入为出。特别注意的是实验过程中会发生很多不可预见的意外，增加额外的经费。充分估计到各种情况就能保证实验方案的顺利实施。,13,（二）实验方案的制定 一个完整的动物实验方案应包括以下内容： 1实验动物种属、品种品系、性别、年龄（体重）的选择 2实验组数的确定 3动物实验分组设计的基本类型 单组比较设计 完全随机化设计 随机区组设计 配对设计,14,4每组样本量的确定 每组的样本量反映了同一处理的重复个数。样本量过小，抽样误差大，不易发现实际存在的差异，得不出统计学意义的结论；样本量过大，不符合动物福利的原则，也浪费人力、物力和财力。一般情况下啮齿类大小鼠实验分组每组10-20只，雌雄各半即可满足统计学分析的要求。大动物如兔、犬和猪的实验一般每组6-10只。 一般来说，各组样本量相等时，统计效率最高。在实际工作中，因一批动物中个别不均一性而剔出、实验人员操作技术不熟练或技术复杂、高剂量组因毒性的不确定等而在实验中致动物死亡等的情况屡有发生，因而实际使用的动物数量应比理论计算的样本量要适当增加。,15,5实验处理方法和指标的选定 实验处理方法包括处理因素、处理时间、次数、强度（剂量）、途径等，这些都要在实验方案中确定下来。 动物实验指标一般包括两部分：试验期间活体观察指标和实验结束处死解剖观察取材测试指标。 试验期间活体观察指标 包括一般观察、无创伤性测定指标和创伤性测定指标。 一般观察包括动物的精神、行为、营养、被毛、摄食情况、大小便及口鼻耳阴部分泌物等,一般无需惊动动物； 无创伤性测定指标包括心电图、血压、呼吸、自主活动等测试，有的需要无线遥控设备。无线遥控无创伤观察测试可避免干扰动物，减少动物应激，因而测试数据准确、可靠。 创伤性测定指标包括手术、取血取材等，对动物长期观察忽多忽少产生影响。实验设计时要考虑研究团队有无技术基础和实验条件，以及评估创伤性试验对动物试验的影响。 实验结束处死解剖观察取材 测试涉及到麻醉、取全血/血浆/血清、脏器称重、病理组织取材及固定等一系列步骤，可依据实验目的和检测指标选择部分或全部进行。,16,由于动物实验几乎涉及到基础和临床各个学科，不同的研究有不同的目的和要求，所用的试验方法、仪器设备和指标也各不相同，但无论选择何种实验方法，均应力求做到以下几点： (1) 可靠性：即方法切实可行、指标稳定可靠，是受大家公认的方法，也称经典方法。 (2) 客观性：尽量选用仪器设备检测，避免主观描述；能用定量指标的就不要选用定性指标。 (3) 先进性：当今重大科研成果的出现几乎都利用了先进的仪器设备、技术和检测指标，将整体动物实验与细胞水平、分子水平检测指标结合起来进行综合分析。因此充分利用本单位或其它单位的先进仪器设备为自己的课题服务对于提升课题的级别，提高试验质量有着重要意义。,17,6. 实验周期的确定 一个动物实验周期要持续多长时间取决于实验目的和是否能从动物实验中得到所需要的试验结果。例如，用兔制作动脉粥样硬化模型，饲喂高脂、高胆固醇饲料后一个半月，兔的主动脉上可产生肉眼可见粥样斑块，表明造模成功。如果此时用药物干预治疗，还需要再增加4周以上治疗时间，总的实验周期在3个月左右。在实验设计中需参照文献报道或根据相关实验室的经验，或通过预试验摸索。,18,（三）药物剂量的设计和换算 中医药实验研究中很大一部分是药效学和毒理学研究，实验研究结果的好坏与剂量设计有很大的关系。一个疗效好的药物剂量过小可能在实验中显示不出药效，剂量过大可能暴露其毒性作用。因此准确的剂量设计对试验的成功起着重要的作用。 如果研究的是一种新药，没有临床资料和动物试验资料，那么只能通过设置多个剂量进行预试验摸索。 如果有人的临床用药剂量或动物实验参考剂量，那么可转换成不同动物的等效剂量。研究证明药物的等效剂量不是与动物的体重成正比的，而是与单位体重的体表面积成正比的，因此小动物的等效剂量往往是人的数倍。,19,注：引自黄继汉等,药理试验中动物间和动物与人间的等效剂量换算.中国临床药理学与治疗学.2004,9(9):1069-1072。括号中数值单位为kg。,标准体重动物由动物a到动物b的mg/kg换算系数,20,中医在长期的临床实践中，对一般常用中药的用量积累了丰富的经验，规定了每味中药的临床用量。在实验研究中，可将人的临床用量换算成动物的用量。 中国药典2010年版规定中药雄黄的人临床用量为0.05-0.1g，换算成小鼠的用量是多少？ 答：按人临床最高用量0.1g、体重60kg计算，得1.7mg/kg，换算成小鼠用量时查表1人a行小鼠b列的换算系数为12.33，故小鼠的等效剂量是1.7mg*12.33=21.0mg/kg。 已知某药20g小鼠用4mg/kg，换算成8kg比格犬的用药剂量？ 答：查表1小鼠a行，比格犬b列的换算系数为0.15，故比格犬的剂量=40.15=0.60mg/kg 以上换算是在各种动物标准体重情况下进行的。如果动物a和动物b中一种或两种都不是标准体重，就需要根据表9-2折算成与标准体重的比率（B=W/W标），再乘以校正系数。,21,非标准动物的换算： 非标准动物换算成标准动物：给药剂量校正系数Sa 换算系数 标准动物换算成非标准动物：给药剂量换算系数校正系数Sb 非标准动物换算成非标准动物:给药剂量校正系数Sa 换算系数校正系数Sb 例3：长期毒性试验350g大鼠用10mg/kg，换算成8kg比格犬的用药剂量？ 答：查表2，B=W/W标=350/150=2.3，校正系数Sa=1.301。再查表1大鼠a行，比格犬b列的换算系数为0.30，故8kg比格犬的剂量=101.3010.30=3.90mg/kg,22,表. 非标准体重动物的校正系数,23,第二节 动物实验准备与预实验,一、知识和技术的准备 1. 掌握有关实验动物方面的基础知识 2. 掌握有关动物实验方法学方面的基本技术。 二、实验条件的准备 准备好实验仪器、药品、试剂和实验动物等，尽可能使实验手段和实验方法标准化。 应注意以下几个方面问题： 1）了解和熟悉进行动物实验的各项规章制度，并严格遵守这些规章制度。,24,2）进行咨询和预约登记，如实申报动物实验的名称、课题来源、动物实验的起止日期、所用动物的品种品系、等级、数量、年龄、性别等，并说明供试品是否有毒、有害、有感染性或放射性等、实验的特殊条件和要求，以求得与实验动物室进行沟通，落实动物到达时间，安排饲养和实验场所。 3）对于有毒、有害、有感染性或放射性的动物实验，应在相应的动物实验设施设备内进行，并执行有关的规章制度。 4）由于屏障系统管理严格，为防止病原微生物的带入，从屏障系统内拿出的动物不允许再进入屏障系统，因此动物实验中所需的仪器设备需在实验动物室的指导下经消毒后方可带入屏障系统。,25,三、预实验 预实验是实验者在正式实验前对实验方法和条件以及实验对象磨合为一个整体的过程，是正式实验前的模拟或者演习，其目的在于检查各项准备工作是否完善，人员是否配齐，实验方法和步骤是否切实可行，技术是否熟练，仪器设备是否运行正常，测试指标是否稳定可靠，剂量是否设计合理等，了解实验结果与预期结果的距离，从而为正式实验提供补充、修正的意见和经验，是动物实验必不可少的重要环节。预实验可有效地避免匆忙进入正式试验后才发现很多实验细节准备不充分，以至于影响实验进展的现象。因此，预实验不仅不会浪费钱财，而且会有事半功倍的效果，增强正式实验成功的信心。 预备实验可使用少量动物进行，实验方法和观测指标应和正式试验一样。但是，预备实验的结果不能归入正式试验的最后结果中一同分析。,26,第三节 动物实验数据收集与处理,动物实验数据是指在动物实验过程中对动物采取某种（或多种）处理的观察记录或用物理、化学的方法检测而获取的原始资料或数据。原始资料还包括照片、图片和视频记录。 通过对实验数据的记录，贮存，分类和整理，可使研究资料系统化，便于后期对实验数据进行统计处理。可以说，实验数据的收集和整理是实验结果分析和评判的基础，也是动物实验最重要的工作内容之一。,27,一、实验数据的记录与贮存 （一）实验数据的记录 设计记录实验数据的表格 准确记录实验数据 保存仪器设备自动打印的原始数据 （二）实验数据的贮存 一般记录的介质有实验专用记录本（卡）、计算机的硬盘、光盘、U盘等。 应做好必要的数据备份。,28,二、实验数据的检查与核对 三、数据缺项与差错的处理 四、实验数据的分类与整理 应先区别原始数据是数量性状资料还是质量性状资料。不同类型的数据采用不同的整理方法。 （一）数量性状资料 1.计数资料：指用计数方式而获得的资料。这类资料每个变量或变数（variable）必须以整数表示，在两个相邻的整数间不允许有带小数的数值存在。如产仔数、成活数、雌雄数等。 2.计量资料：指通过直接计量而得来的以数量为特征的资料，系用度量衡等计量工具直接测定的。如体重、血压、肺活量、脏器重量等。,29,（二）质量性状资料 指一些能观察到而不能直接测量的性状资料，又称属性性状资料。如毛色、性别、生死等。对于质量性状资料的分析，必须将质量性状数量化，其方法有： 1.统计次数法：根据动物的某一质量性状的类别统计其次数，以次数作为质量性状的数据。在分组统计时，可按质量性状的类别进行分组，再统计各组出现的次数。 2.评分法：对某一质量性状，因类别不同，分别给予评分或用数字划分等级，如动物对某一病原的感染程度，可分为0(免疫)、1(一过性感染)、2(顿挫性感染)、3(致死性感染)；病理组织坏死情况可分为：无（-），25%以下坏死（+），2550%坏死（+），50%75%坏死（+），75%以上坏死（+）。这样就可将质量性状资料量化，以利进一步统计处理与分析。,30,五、实验数据的统计学处理 与物理、化学试验可精细定量分析不同，动物是一个非常复杂的生命体，生命现象的特点是具有变异性（个体之间存在差异）、随机性（变异不能准确推算）和复杂性（影响因素众多，有些是未知的），如一组动物接受同一处理后得到的反应数据是各不相同的，但大多以平均数为中心作正态分布。用常规的数学方法不能进行分析，只能依靠生物统计学方法用概率进行分析。 生物统计学处理数据的方法很多，最常用的统计学方法有：各组间计量资料的比较用方差分析法（F检验），各组间计数资料的比较用卡方检验（X2检验），通过概率计算得出各组间差异是否具有显著性意义。一般认为两组数据之间差异概率P0.05具有显著性意义，P0.01具有极显著性意义，表明两组数据之间的差异不是抽样误差，而是处理因素作用所致。 现在一般实验数据的统计学处理有专用软件，如SPSS、SAS、SYSTAT、GraphPad Prism等。,31,第四节 动物实验结果分析及应注意的问题,一、实验结果的分析与解释 建立在真实可靠的事实和数据之上 科学、合理的解释 不要轻易否定自己在严密的实验设计和严谨认真的实验操作下做出的实验结果和结论,32,二、动物实验结果的评价 动物实验结果的外推 动物和人之间的差异可能导致动物试验结果并不一定在人身上可以重复出来，有的甚至是相反的。因此将动物实验结果的数据简单外推到其他物种(包括人类)上将可能是不可靠的。 在肯定一个实验结果时最好采用两种以上动物进行比较观察。一般所选的实验动物中一种为啮齿类动物，另种应为非啮类动物。啮齿类动物选用小鼠或大鼠，非啮齿类动物选用犬或猴。如一种实验处理在多种动物身上产生共性结果，往往用在人身上也会有意义。,33,2. 谨慎评价近交系动物实验结果 近交系动物因其遗传背景清楚，实验研究结果数据整齐、重复型好，目前制作的很多突变系疾病动物模型的突变基因大多导入到近交系遗传背景中。但不同近交品系具有各自不同的敏感特性，在近交系育成过程中所造成的近交衰退与人体的正常生理条件差异很大，因此在某些研究中很难说正确地反映了人体的条件。对近交系动物的实验结果评价更要慎重，避免因实验结果的误导而造成难以想象的后果。,34,第五节 动物实验研究的局限性,一、动物实验研究仅是生物医学研究诸多手段中的一个 生物医学研究的领域和范围很广，动物实验研究仅是生物医学研究的一部分。许多人往往认为医学上很多研究离不开动物实验。但是有些疾病如糖尿病、冠心病研究、先天性免疫缺陷症的病因研究等的许多成果并不完全归功于动物实验，而主要是来自人群的流行病学调查的结果。 癌症研究中也显示出动物实验有一定的局限性。而对人群观察却提供了十分重要的线索。结果表明，多食用蔬菜、水果和低脂肪食物的癌症患者存活的时间更长，而且复发的危险性较小。 此外，有些研究以前用动物实验，现在一般不再采用动物实验。如病毒传代和鉴定以前通常采用动物接种，现在除了个别病毒（如柯萨奇病毒、乙型脑炎病毒以及病因未明的病毒感染）外，普遍采用细胞培养和组织培养技术，因为细胞培养和组织培养生产疫苗的现代方法更安全、更有效。,35,二、动物种属差异可能导致实验结果不一致的现象 药物或化学物质的安全性评价主要在实验动物身上进行。但是，不同种属动物所测得的结果往往不一致，甚至相互矛盾。例如，1988年，Lester Lave在自然杂志上报道，用大鼠和小鼠测试214种化合物的致癌性的双重试验，其反应一致性的仅有70。啮齿类动物和人之间的相关性将会更低。David Salsbur