《检疫性细菌病害》PPT课件.ppt

第六章 检疫性细菌病害,植物检疫性病原细菌的检验方法 梨火疫病 Fire Blight 玉米细菌性枯萎病 Stewarts bacterial wilt of corn 柑橘黄龙病 Citrus Yellow shoot 椰子致死黄化病 Coconut Lethal Yellowing,复习思考题,植物病原细菌检疫检验技术,直接检测：直观检验和生长检验 间接检测 活菌检测 免疫吸附分离法 噬菌体检验 非活菌检测 血清学检测,1、活菌检测,分离培养法：营养培养基、选择培养基或鉴别培养基分离纯化得到的细菌 浓缩接种及离体叶检测：提取液浓缩接种感病植物，观测发病情况。 例如：浙江大学等在1灭菌水琼脂中加75106的苯并咪唑，做平板，加感病植物叶片，针刺摩擦接种，培养（光、温、湿度），短期获得症状。主要应用于水稻细菌性条斑病菌和小麦细菌性黑颖病菌的检测。,2.免疫吸附分离法,原理：接合血清学与平板分离技术，利用与抗原高度亲和性的抗体，来捕获目标细菌，样本中其他细菌均被冲洗掉，再将目标细菌转移或释放到培养基上生长。 方法：平皿免疫吸附评价测定法和免疫吸附稀释培养法 平皿免疫吸附评价测定法简略流程如下：,常用溶入丙酮的硝酸纤维素或指甲油作包被,洗涤液使用包被缓冲液,3.噬菌体检验,原理：噬菌体侵染细菌，裂解寄主细胞，在液体培养时，会使浑浊的细菌悬浮液变清，在固体平板上培养，则出现许多边缘整齐、透明光亮的噬菌斑。噬菌体具有专化性，利用此特点，可鉴别细菌的种类。,4.非活菌检测,非活菌检测的方法很多，下表是检测病原细菌常用的一些方法，前9种血清学方法，均属非活菌检测。它们既能用于病原鉴定，又能直接用于病种或病株，甚至是无症感染组织的检测。,5.血清学检验,原理： 方法：酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫荧光抗体法 免疫荧光抗体法：将荧光染料（异硫氢酸荧光黄或罗丹明）与抗体以化学方法接合，再与抗体反应，形成有荧光标记的抗体抗原复合物，在荧光显微镜下，可观察到黄绿色荧光。,梨火疫病 Fire blight of pear,分布：,1878年首先由burrill描述，在纽约发生，后由Erwin命名，是第一个被确定的植物细菌病害。主要分布于北美洲于西北欧，中欧、地中海、东南欧及大洋州和亚洲也有分布。大约40多个国家。,梨火疫病的地理分布,寄主： 梨火疫病菌寄主范围很广，能为害梨、苹果、山楂、木旬子、李等多个属220多种植物，大部分属蔷薇科Pomoideae亚科。 危害性： 仁果类果树的一种毁灭性病害。一棵多年生的梨和苹果树发病后可在几星期内死亡,症状：侵害花、果实、枝条和叶片。 花:侵染后变深褐色，枯萎。 叶片:从叶缘沿叶脉扩展，先呈水浸状，后黑褐色。 嫩稍:先水浸状，后褐色至黑色，向下弯曲，呈鱼钩状。 果实：病部褐色凹陷，扩展到全果，潮湿时病部生粘稠的细菌溢，初乳白色，后红褐色。 病枝:叶片凋萎，幼果僵化，但病叶病果不脱落，远望似火烧状，故称火疫病。 伤口：初期水浸状，后下陷，呈溃疡斑，病健交界处产生龟裂纹，韧皮部红褐色，有黏液状菌脓。 严重时，病害从嫩稍很快扩展到枝条、主干，直至根部，全株死亡。,Advanced fire blight on fruit - note bacterial ooze on fruit.,Fireblight in nursery stock,主要鉴定特征： 梨火疫病最典型的症状是花、果实和叶片受火疫病菌侵害后，很快变黑褐色枯萎，犹如火烧一般，但仍挂在树上不落，故此得名。目前国际上将其症状据受侵害的部位，分成个阶段。,（1）花枯萎：侵染开放的花引起花枯萎。一般发生于早春，病菌直接从花器侵入，初为水渍状斑，花基部或花柄暗色，不久萎蔫。病菌可扩展至花梗及花簇中其它的花；在温暧潮湿条件下，花梗上有菌脓渗出。随着枯萎发展，花梗、花等变褐至黑褐色，条件适宜时可继续侵染杀死小枝并形成小溃疡斑。,（2）溃疡枯萎：是指前一季越冬溃疡边缘的病菌重新复活的结果。初症是在复活的溃疡附近的健康树皮组织上出现窄的水渍状区，几天后，树皮内部组织出现褐色条斑，随后病菌侵入附近繁殖枝内部并引起萎蔫死亡。这些枝条特别是嫩枝与下面谈及的枝枯萎有明显区别，即在萎蔫之前枝尖芽褪色（黄至桔黄色）。,（3）枝枯萎：细菌直接侵入前 13叶的枝尖，然后杀死整个枝条及支持枝。初症是枝尖萎蔫，但萎蔫前不褪色，象拐杖状。条件适宜时，几天内可移动1530cm，造成整枝死亡，病枝、枝皮、叶通常变黑。潮湿时，枝条上出现菌脓。后期，终芽前出现的枝枯萎一般不会萎蔫，且仅在枝最上部出现坏死。随着病菌不断深入，并侵染主干，皮层收缩，下陷，形成溃疡斑。,（4）病菌亦可直接从气孔、水孔等自然孔口或蕾苞，或由风引起的伤口侵入叶片，初叶边坏死，并向中脉、中柄、茎扩展，后变黑，通常有菌脓。 （5）损伤枯萎和砧木枯萎：这二种比较特殊，前者主要是由于晚霜、冰雹或大风损伤引起，如果实 很容易引起果实枯萎。后者仅限于高感品种EMAL-26、 EMLA-9和MARK-39砧木。通常是由感病的接穗在这些砧木上发病后引起，最终成溃疡带而杀死树体。,病原菌： 学名：Erwinia amylovora（Burrill）Winslow 异名： Micrococcus amylovorus Burril Bacillus amylovorus (Burrill) Trevisan Bacterium amylovorus (Burrill) Chester 分类地位：原核生物界(Procaryotes),薄壁菌门(Gracilicutes),肠杆菌科(Enterobacteriaceae)欧文氏菌属(Erwinia)解淀粉欧文氏菌,形态特征：直杆菌，有荚膜，周生鞭毛，能运动，大小为0.9-1.8 0.6-1.5m，多数单生，有时成双或短时间内3-4个呈链状。革兰氏染色阴性。在蔗糖培养基上27下培养3d，菌落直径34mm，白色至奶油色，半球形隆起，有黏性，表面光滑，边缘整齐，中心绒环状。,生物学特性：兼性厌氧，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性，好气条件下利用葡萄糖产酸不产气，厌氧条件产酸缓慢。明胶碟形液化缓慢。不产生硫化氢，不利用丙二酸盐。葡萄糖酸盐氧化和七叶苷水解不稳定。氯化钠浓度高于2以上时生长延缓，至67%时则完全抑制。 抗青霉素，对氯霉素、链霉素和土霉素敏感。 细菌生长的温度范围637 ，最适温度2527.5，致死温度4550，10 min，最适酸碱度为PH6.0。,梨火疫病菌以简单的细胞分裂繁殖，一个细胞在条件适宜时，天内在寄主植物组织中能达到109细胞，每个细胞都是一个侵染源，感染寄主而引起病害的发展。除蛋白酶外，病菌不产任何有助于侵入寄主的酶，主要是在环境条件适宜时，通过胞间组织侵入薄壁组织的病菌产生胞外多糖。胞外多糖在病害发展过程中起重要的作用，其是菌脓的重要成份。菌脓的理化性质随湿度变化而变化，干时皱、硬，大时膨胀易被雨水扩散，中等湿度的菌脓粘易被昆虫、风传播。,发病规律： 病菌在病株病疤边缘组织处越冬，挂在树上的病果也是越冬场所，如果冬季温和，病菌还能在病株树皮上度过，来年早春病菌在上年的溃疡处迅速繁殖，遇到潮湿、温和的天气，从病部渗出大量乳白色粘稠状的细菌分泌物，即为当年的初侵染源，通过昆虫、雨滴、风、鸟类以及人的田间操作将病菌传给健株。病菌亦通过伤口、自然孔口（气孔、蜜腺、水孔）、花侵入寄主组织，有一定损伤的花、叶、幼果和茂盛的嫩枝最易感病。,传播途径 近距离传播：雨水是果园短距离传播的主要因子，其次风亦是中短距离传播的重要因子，往往在沿着盛行风的方向，病原菌以单个菌丝、菌脓或菌丝束被风携带到较远距离。除次之外，昆虫对病菌的传播扩散起一定的作用。传病昆虫包括蜜蜂在内有77个属的100多种昆虫，其中密蜂的传病距离约为200 400 m 。 远距离传播：主要是感病寄主繁殖材料，包括种苗、接穗、砧木、水果、被污染的运输工具、候鸟等。,梨火疫病的远距离传播,发生条件： 受伤的花朵、幼果和嫩稍最易受病菌侵染。经冰雹袭击，病害蔓延更加迅速。较高气温（1824）和较高的湿度（70以上）有利于病菌侵染。,检验方法： 1.产地检验： 2.症状观察：梨火疫病的症状很典型，是鉴定的重要方法，但必须与其他症状相似的梨梢枯病区分开。梨梢枯病仅限于危害花器、叶片和嫩梢，不危害枝条和茎干，病部无细菌溢脓，叶片上最初为深褐色斑点，周围有红色晕圈，枯死的病叶不会长期挂在树上,3.分离培养 可采用选择性培养基和鉴别性培养基进行。 MS培养基 菌落为红橙色，背景为兰绿色。配方：琼脂20g，甘露醇10g， L-天门冬酰胺3g，牛胆酸钠2.5g，磷酸氢二钾2.0g，烟酸0.5g，MgSO47H2O0.2g，次氮基三乙酸0.2g，硫酸十七烷基钠0.1ml，0.5%溴麝香草酚兰水溶液9ml，0.5%中性红2.5ml，蒸馏水970ml，pH7.3灭菌后加1%放线菌酮5ml，1%硝酸铯水溶液1.75ml。 CG培养基 在29培养48小时后形成典型的火山口状菌落。配方：水380ml，蔗糖160g，营养琼脂12g，结晶紫0.8ml（1%乙醇溶液），0.1%放线菌酮20ml。,4.致病性实验 梨火疫病菌致病性试验可用梨片或梨嫩枝测定，亦可用烟草过敏反映检查。NA上培养48小时的细菌配成108 cells /ml的悬液，注入烟草叶片或接种于1cm厚梨片、或针刺接种于丈长的巴黎枝条，28下培养，一般1012小时后，烟草注射区出现白色坏死斑。13天后，梨片或枝条上出现白色菌脓，则可确诊。 5.血清学检验：免疫荧光、ELISA、ODD和凝集实验 6.分子生物学方法：核酸探针和PCR技术,检疫和防治 1.严格检疫，禁止从疫区引入蔷薇科仁果类果树树苗。 2.剪除病梢病枝。 3.药剂防治：120mg/kg链霉素喷雾，或花期用波尔多液喷雾防治，效果很好。 4.种植抗病品种： 5.避免在低洼易涝地定植。芽前刮除发病树皮，在生长季节每隔7天检查1次各种发病新梢和组织，发现后及时剪除。对因各种农事操作造成的伤口都要进行涂药保护等。,玉米细菌性枯萎病 Stewarts bacterial wilt of corn,分布：1889年纽约首先报道，现已20多个国家。分布于美国、加拿大、墨西哥、越南、泰国、马来西亚、前苏联、波兰、瑞士、意大利、前南斯拉夫、罗马尼亚、希腊、哥斯达黎加、波多黎各、圭亚那、秘鲁、巴西。,寄主植物 主要是甜玉米，也侵染马齿玉米、粉质玉米、硬粒玉米和爆裂玉米。 危害： 维管束病害、毁灭性病害。,症状：整个生育期都可危害，以开花期症状最明显。早期症状表现为植株矮化，萎蔫，雄穗退色早枯，叶片边缘产生波纹状不规则病斑，初期水浸状，黄色，与叶脉平行，贯穿全叶，宽110mm，严重时病叶萎蔫死亡。生长后期，叶片产生许多小病斑，结合成大块，火烧状干枯死亡。髓部有空腔，导管被黄色黏液阻塞，萎蔫植株的下部切口有黄色细菌溢脓。果穗的菌脓可通过内层包叶的气孔渗出，籽粒表面沾满细菌菌脓，病籽粒变形、皱缩和变色。,Necrotic lesions on mature leaves; second phase of Stewarts wilt disease.,病原菌：玉米细菌性枯萎病菌 学名 Pantoea stewartii (Smith) Mertaert et al. 异名 Erwinia stewartii (Smith) Dye；Pseudomonas stewartii Smith; Apalnobacter stewartii (Smith) McCulloch; Bacillus stewartii (Smith) Holland; Bacterium stewartii( Smith) Smith; Phytomonas stewartii (Smith) Bergye et al; Pseudobacterium stewartii (Smith) Hrasilnikov,1949; Xanthomomas stewartii (Smith) Dowson 英文名 Stewarts bacterial wilt of corn 分类地位 原核生物界(Procaryoces)，薄壁菌门(Gracilicutes)，肠杆菌科(Enterobacteri-aceae)，泛菌属(Pantoea),形态特征：好气性短杆菌，两端钝圆，无鞭毛，有荚膜，G，单生或双生，0.40.80.92.2。在牛肉膏培养基上形成黄色圆形菌落，全缘，表面扁平光滑，能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、木糖、甘油鹤甘露糖、醇等产酸，但不产生气体。在肉汤培养液中生长微弱，形成灰色环和黄色沉淀物。 细菌生长温度最低温度89，最适温度30，最高温度39，致死温度53 10min，适宜PH4.58.5，最适6.08.0。,发病规律：初侵染来源带菌的种子和昆虫。土壤和病原残体不能越冬，昆虫是病原细菌的传播介体和重要的越冬场所。最重要的传病昆虫是玉米叶甲，它以成虫带菌越冬，细菌存在于消化道中。越冬后现在早播玉米苗上取食，引起初侵染，并产卵发育成新一代成虫，继续向其它植株传病。,Corn flea beetle (Chatocnema pulicaria) vector of the Stewarts wilt bacterium (Pantoea stewartii).,流行条件：发病与流行主要决定于冬季气温（12、1、2月）的高低，若平均气温总和在37以上，有利虫媒越冬，带菌昆虫成活率高，有可能引起发病。低于32则很少流行。此外有利于发病的条件包括土壤氮肥水平偏高，钾肥水平偏低，高温高湿等。,检验方法： 产地检验： 种植检验：种子长出的植株有明显的症状。 分离培养基：采用伊凡诺夫选择培养基，其成分如下： 甘油30ml 柠檬酸铁铵10g 磷酸氢二钾2 . 5g, 氯化钠15g 硫酸镁0.1g, 琼脂17g 氯化钙0.1g, 蒸馏水1000ml,PH7.0 为了抑制杂菌的污染,还可采用选择性黑色素培养基,其成分如下: 酵母浸膏 1g 甘油 30ml 制霉菌素 200mg/ml 牛胆酸钠 3g 氯化钠 15g 1%水溶性黑色素20ml 琼脂 17g 蒸馏水 1000ml PH6.7 30下培养7d，对光观察，菌落中心呈黑色，边缘透明，菌落圆形，表面光滑，呈粘状。 将分离的细菌接种在玉米苗上，验证是否发病。,4.噬菌体检验法：用专化性噬菌体，如ZP6、ZP82等检验。 5 .血清学检验：用酶联免疫法等检验。 检疫和防治 1.禁止从国外疫区进口玉米种子 2.种子处理： （1）微波炉70处理10min，效果很好。 （2）环氧乙烷熏蒸： （3）恒温处理：50下处理4d，消灭种子内部细菌效果显著，不影响发芽。 （4）抗菌素温浸法： 3.防治传播媒介昆虫： 4.种植抗病品种：,柑橘黄龙病 Citrus Yellow shoot,分布：1939年在中国广东发现该病，现已扩展到亚洲和非洲37个国家和地区，中国主要发生在广东、广西、福建、台湾、海南、云南、贵州、四川、浙江、湖南、江西等省。 寄主：主要是柑橘属、金柑属和枳属。草本植物有长春花 。,危害：是柑橘的毁灭性病害，感病的柑桔品种得病后可在35年内丧失结果能力，甚至枯死。 症状：典型症状是在浓绿的树冠中出现12条或多条的发黄枝梢，有两种类型：一种是整张叶片均匀黄化 ，另一种是叶片呈黄绿相间的斑驳状 。共同特点是叶质硬化、无光泽，但在黄梢下部的老叶仍呈正常绿色。病果小，果皮光滑，畸形，无光泽，味酸，果皮着色时黄绿不均匀或在果蒂附近变橙红色，而其余部份仍为青绿色的青果,病原Liberobacter asiaticum （亚洲）、 Liberobacter africanum（非洲） 分类地位：原核生物界(Procaryoces)，薄壁菌门(Gracilicutes)，韧皮部杆菌属 Liberobacter 英文名称：Citrus Huanglongbing；Citrus Yellow shoot；Citrus greening,未能在人工培养基上分离获得纯培养，在电镜下为椭圆形或短杆状的细菌，大小为306005001400m，细胞壁厚度为2530 m。革兰氏染色阴性，对四环素及青霉素敏感。根据其对热的反应和传病木虱的不同，分为两个株系：在亚洲，其发病的最适温度为2732，传播介体为亚洲木虱（Diaphorina citri），病原为柑桔黄龙病原亚洲株系（L. asiaticum）；在非洲，其发病的最适温度为2024,传播介体为非洲木虱 （Trioza aryteae） 病原为柑橘黄龙病非洲株系（L. africanum）。可以通过嫁接及菟丝子传播，但不能通过汁液和土壤传播。,传播：远距离传播主要是来自病区调运的苗木、接穗；大田主要依靠柑橘木虱进行传播，在亚洲是亚洲木虱，在非洲是非洲木虱 。 发生条件：亚洲多发生在热带亚热带地区，喜高温；在非洲多在冷凉气候下发生，30以上高温病害受抑制。,检验与检测： 1.产地检验：每年1012月症状表现最明显 2.生物学诊断：鉴别寄主法 3.电镜检查： 4.荧光显微镜检查：黄色荧光 5.化学诊断：染色法 6.血清学检测：,检疫与防治： 1、实行检疫 禁止病区苗木及一切带病材料进入新区和无病区，新开辟的果园要种植无病苗。 2、建立无病苗圃，培育无病苗木 要切实做到对优良单株进行脱毒（茎尖嫁接脱毒或热力脱毒）并经鉴定证明不带菌；在网室内建立种质圃；在隔离地方或在网室内建立无病母本园；在隔离地方或在网室内建立无病苗圃。 3、挖除病株 发现病株或可疑病株，应立即挖除，用无病苗进行补植。 4、防治柑桔木虱 通过水肥管理控梢以减少木虱繁殖和传播。新梢期喷布12次杀虫剂。果园四周栽种防护林带，对木虱的迁飞也有阻碍作用。,椰子致死黄化病 Coconut Lethal Yellowing,分布 椰子致死黄化病的名称来源于Nutman and Roberts (1955)。他们首次用致死黄化（lethal yellowing）命名在加勒比海、牙买加西部地区发生的一种椰子致死黄化型的毁灭性病害。该病害在加勒比海地区至少已有100年的历史，在西非也有50年的历史。目前分布在拉丁美洲开曼群岛、巴哈马群岛、古巴、多半尼加、海地，非洲和西印度群岛，亚洲的印度尼西亚、辛都、马来西亚、美国佛罗里达洲南部地区等地也有报道。,寄主范围： 除为害椰子树(Cocos nucifera L.)外，还可以为害油棕、枣椰子、扇棕、马尼拉棕、海棕等30多种棕榈科植物。大部分椰子品种抗病性差，在棕榈科的15个主要类群中，至少有7个是感病的。感病寄主属包括：Allagoptera，桄榔属 Arenga，Arikuryroba，Boraxxus，鱼尾属Caryota，散尾属Chrysalidocarpus，椰子属Cocos，Corypha，Dictyosperma，Gaussia，Hyophorbe，Latania，薄葵属Livistona，Mascarena，Nannorrhops，刺葵属Phoenix，Pritchardia，棕榈属Trachycrpus，Veitchia。,危害情况: 是椰子和棕榈科植物的毁灭性病害。在牙买加，据统计1961年的600万株感病的Jamaica Tall椰子中的90在1981年因感染黄化植原体而死亡。在加纳，在过去的30年中，已有约100万株椰子因感病而死亡；在多哥，截至1964年，约60000株或50的椰子树因感病而死亡；在Florida，到1973年，至少20000株(约6)的椰子树感病。在墨西哥和坦桑尼亚，成千上万公顷的椰子已被病害侵袭而死亡。,症状：各龄椰子树均可感病。病害早期的典型症状是花序干枯。开始时顶部复叶有褐色枯死斑，可深入到裹在里边的羽状叶，再向深处扩展，最后致死生长点，未成熟的果实脱落。开花的花序轴从顶端开始坏死、变黑，佛焰苞未成熟就提前开放，然后凋萎、落花、落果。以后叶片开始黄化，下层的叶片迅速发展到主株叶片，直至脱落。芽片感染后表现有不规则的褐色水浸状条斑，逐渐发展到芽腐，并有恶臭味。此时新叶很容易被剥离掉。在叶部呈现黄化症状时，根系出现坏死，不久腐烂，根系受害死亡。,总之,叶片黄化症状是植原体侵入根系后导致生理学、生物化学变化的结果。一般椰子黄化植原体病症状发展过程如下： 大多数感病植株在果实成熟前提前落果 新开的花序黑化 从下部叶片到上部叶片逐渐黄化 针形叶死亡和脱落，可能仅保留少量绿叶 整个树冠脱落，仅留赤裸的呈线杆状枝干,病原：椰子致死黄化植原体 学名 Coconut lethal yellowing Phytoplasma 英文名 Coconut lethal yellowing 分类地位 原核生物界，无壁菌门，软球菌纲，植原体属（MLO）,形态特征 电镜下，典型的植原体颗粒存在于病株的筛管中。颗粒是卵形、椭圆形、及丝状，由三层结构组成即：两层电子密集层，中间隔一层透明层。在感病椰子树韧皮部筛管细胞内可见植原体的存在，形状包