目的基因的克隆与基因文库的构建精美生物医学.ppt

基因文库,请你找找看,什么是基因文库，由哪两部分组成呢？ 构建基因文库由什么用呢？ 构建一个基因文库都有哪些基本步骤，请概括！,一基因文库概述,1、概念 基因文库 (library)：一套包含某生物体 所有基因的DNA序列。 这些序列分别与适当的载体结合在一起。,2、基本组成,包括：基因组文库、cDNA文库 cDNA：由mRNA逆转录的DNA，因此不 含非转录的基因组序列。 单链cDNA可由DNA聚合酶转变成双链，应用于基因工程。,基因组文库 Genomic DNA library,使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组DNA切割成许多片段 将所有片段连接到载体上，构成一个重组DNA群体 这个群体包含全基因组的遗传信息,cDNA文库（ cDNA library ）,以mRNA为模板，经反转录酶合成互补 DNA(complementary DNA，cDNA) 将双链cDNA与适当载体连接 转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNA文库,基因组文库与 cDNA文库的比较：,基因组文库包含基因组的所有基因 cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列 分离特定基因，cDNA库比较方便 研究调控序列，必须用到基因组文库,3、构建目的,创建基因文库的目的：从特定的材料中分离目 的DNA片段或基因。 把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方法在库中筛选目的基因。 同时也便于基因的长期保存。,4、 基因文库的构建流程,（1）基因组文库的构建,提取某生物 全部DNA,用适当 限制酶切割,许 多 DNA片段,与载体连接 导入受体菌群,该生物基 因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA,与载体连接 导入受体菌群,该生物 cDNA文库,5、基因文库的质量标准,尽可能高的完备性,重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力,载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆,克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序,克隆片段易于从载体分子上完整卸下,重组克隆能稳定保存、扩增、筛选,二、目的基因的克隆,1、直接分离法“鸟枪法”,载入运载体,导入不同的受体细胞,大量复制和表达,找出含有目的基因的细胞,限制酶将DNA切成许多片段,鸟枪法克隆目的基因的局限性,工作量较大，需要了解目的基因的背景知识,不能获得的最小长度的目的基因,不能除去真核生物目的基因的内含子结构,2、人工合成基因法：,1）逆转录法：,mRNA,双链DNA (即目的基因),2）直接合成法：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因（双链）,化学合成,3、通过DNA合成仪直接合成目的基因,DNA合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN 核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。,4、利用PCR技术扩增目的基因, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,1.目的基因受热变性，解旋； 2.引物与单链互补结合； 3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。,(2)利用PCR技术扩增,原理：_,DNA复制,条件：_、 _、_ 、 _ (做启动子)。,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶、解旋酶,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,指数,2n,结果：,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,过程：,a、DNA变性（90-96）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性25-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,三、基因文库的构建,（一）切割：基因组DNA的分解,用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和,限制性内切酶部分酶切两种方法。,超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头,部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：,Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控,连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级,分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！,载体和受体的选择,出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒； 对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC载体 由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒,上述几种载体的最大装载量如下：,质粒 l-DNA,考斯质粒,15 kb,25 kb,45 kb,YAC,400 kb,用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌,密集铺板（1-10万）,杂交,挖取,铺板,铺板,目的重组克隆,二、筛选：从基因文库中筛选目的基因,从基因库中筛选特定的克隆,一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底在哪个克隆上呢？ 根据待选基因相关信息 确定筛选方法和条件。 最常用的方法是利用DNA探针，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，筛选基因文库,DNA探针（probe）,探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列 DNA、cDNA、寡聚核苷酸 单链、双链 同位素标记、荧光标记、颜色标记,筛选文库,质粒基因库筛选 细菌混合液在培养在平板上 转移到尼龙膜上 裂解细菌 变性DNA 标记探针 杂交 漂洗 放射自显影或荧光检测 挑取对应菌落、培养 抽提质粒,阳性克隆的分析与鉴定,从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因 测序 自动测序仪 功能分析 预测软件,磷酸二脂键,测序电泳图谱,基因测序及分析,序列测定的技术,杂交测序法 质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法 DNA 芯片法,经典方法: Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977) Maxam-Gilbert DNA化学降解法(Maxam &Gilbert,1977),新技术方法:,与 PCR反应类似。 反应体系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物； 反应过程： 变性复性延伸终止,Sanger双脱氧终止法,Dideoxynucleotides （双脱氧核苷酸）,ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制， 一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。 反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般1：34)。,*,少一个OH,脱氧核甘酸 与 双脱氧核甘酸 结构比较,Sanger第一步：加入复制终止剂,荧光检测探头,