药敏试验方法简介.ppt

药敏试验方法简介,耐药菌问题日益严重,“目前药物失去作用的速度与科学家发现新药物的速度差不多。” 摘自WHO报告,抗微生物治疗面临的困境,抗药性问题始终存在 细菌不断获得新的耐药机制 以往对付耐药性的策略收效不显,一、 抗菌药物敏感试验（AST）,预测抗菌治疗的效果； 指导抗菌药物的临床应用； 发现或提示细菌耐药机制的存在，指导合理用药，避免产生或加重细菌的耐药； 监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。,（1）抗菌药物的选择 在我国主要遵循临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的抗菌药物选择原则 A组：对特定菌群常规测试并报告的药物 B组：可常规测试、选择性报告的药物 C组：替代性或补充性药物 U组：仅用于泌尿道感染的抗菌药物,葡萄球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组,肠杆菌科抗菌药物敏感试验推荐分组,假单胞菌属的抗菌药物药物敏感推荐分组,不动杆菌属的抗菌药物药敏试验推荐分组,肠球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组,肺炎链球菌抗菌药物药敏试验推荐分组,药敏试验的折点亦遵照每年最新公布的CLSI标准进行，分为敏感（S）、耐药（R）和中介（I）。,敏感：分离菌株能被测试药物使用推荐剂量时在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制 耐药：分离菌株不能被测试药物常规剂量可达到的药物浓度所抑制；分离菌株可能存在某些特定的耐药机制；治疗研究显示药物对分离菌株的临床疗效不可靠,耐药治疗无效；敏感治疗有效,二、抗菌药物的种类及作用机制,三、药敏试验方法学,纸片扩散法（K-B法） 稀释法（MIC法） 肉汤稀释法 常量稀释法 微量稀释法 琼脂稀释法 E-test法,1.手工试验,2.自动仪器药敏系统,纸片扩散法（K-B法） 原理：抑菌圈的大小反映受试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。,耐药 中介 敏感,R,I,S,Log2. MIC,d1 d2 抑菌圈直径（mm),MIC与抑菌圈直径的线性关系,准备抗菌药物纸片和水解酪蛋白（M-H）培养基； 挑取孵育16 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准；,用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液，然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周； 平板在室温下干燥35min，用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面；,35孵育1624小时，量取抑菌圈直径； 根据抑菌环的直径，按照CLSI标准判读，报告敏感、中介、耐药。,2019/6/24,23,CLSI对K-B法的标准化规定 纸片药物含量、细菌接种浓度、培养基、平皿厚度、孵育时间、环境、判定标准、质控方法等；常规测试、报告的抗生素。 不同的药判定标准不同；不同的菌判定标准也不同。,2019/6/24,扩散法药敏影响因素,培养基 pH值7.2-7.4 营养程度（肠球菌能生长） 厚度 抗生素拮抗剂含量（用29212监控） 钙镁离子含量、锌离子含量（用27853氨基糖苷类和亚胺配能结果监控） 菌悬液 浓度高抑菌环缩小（假耐药） 浓度低则扩大（假敏感）,细菌纯度 气体环境 普通细菌放CO2时由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药 苛养菌放普通环境生长不良，导致假敏感 培养时间 粘液性铜绿需48小时 测量方法,稀释法 以一定浓度的抗菌药物与含有受试菌的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），培养1624h后，通过观察细菌生长现象来测得药物对受试菌的最低抑菌浓度（MIC）。,2019/6/24,稀释法（MIC法）,MIC法：分为常量法和微量法 常量法：肉汤稀释法、琼脂稀释法 微量法：微量肉汤稀释法 简化双浓度折点法 ATB药敏 简化常规浓度分布MIC法 BD、德灵药敏 动力学计算MIC法 VITEK32、VITEK2药敏,肉汤稀释法,不生长 = 抗生素抑制细菌生长 生长 = 抗生素无法抑制细菌生长 MIC (最小抑菌浓度) = 抗生素可抑制细菌生长的最小浓度。,常量稀释法,药敏试验的参考方法： 将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的MH肉汤管中. 过夜培养. MIC 即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一管所标示的浓度值(琼脂稀释法是将対倍稀释后的抗生素加入融化后平衡到50的MHA中再倾制平皿，接种物为一定大小的斑点，浓度也为104CFU/ml). 解释标准(S or R) 是建立在体内可达到的抗生素浓度水平上,微量肉汤稀释法,接种后应充分混匀，但不能有气泡产生 静置培养 培养温度；35 气体环境：所有细菌（包括苛养菌）均置大气环境；厌氧菌置厌氧环境；微需氧菌置微需氧环境；淋菌琼脂稀释法置CO2 培养时间：18小时,药敏结果报告可用MIC（g/ml）或对照CLSI标准用S、R和I报告。 对于稀释法的批量试验，有时需要报告MIC50、MIC90。,2019/6/24,稀释法药敏影响因素,培养基 pH值 7.2-7.4 营养程度 抗生素拮抗剂含量 钙镁离子含量（钙10-25；镁10-12.5g/ml） 菌悬液（5104CFU/ml） 接种效应 浓度高MIC抬高 浓度低MIC压低,细菌纯度 气体环境 所有需氧细菌均放普通大气环境。如果放CO2，由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药 培养时间 真菌需48小时 奴卡菌需5天,E-test法 将稀释法和扩散法的原理结合起来，直接测定药物对受试菌的MIC 。,2019/6/24,MIC 值标注于试条的光面,Etest 试条,毛面贴于MHA上,Etest 操作程序,按照扩散法标准操作涂布接种,贴上试条并培养15-18小时,读取抑菌浓度并按标准解释,细菌生长区,E试条,细菌生长抑制区,256 128 8 0.16,判读MIC,2019/6/24,肺炎链球菌 青霉素 MIC = 3 g/ml,结果读取,BD PhoenixTM -100 凤凰全自动细菌鉴定/药敏检测系统,最大的标本容量：对100个标本同时进行鉴定与药敏测试！,鉴定部分： 51孔鉴定实验 改良经典实验 显色荧光检测 无需附加实验与试剂,药敏部分： 85孔药敏实验 比浊氧化还原（专利） 实测倍比稀释MIC值 药物种类与浓度梯度最多 耐药机制检测同步进行,封闭式设计，安全无泄漏,先进的鉴定/药敏复合板设计,PhoenixTM100鉴定板 革兰氏阳性板、革兰氏阴性板生化反应组合,革兰氏阳性菌鉴定板,革兰氏阴性菌鉴定板,鉴定部分： 51孔鉴定实验,改良经典实验 显色荧光检测,无需附加实验与试剂,鉴定实验方法,在研究了上百种反应底物基础上，选择了45种反应底物。 检测板每20分钟检测一次,Phoenix工作流程,从经过夜纯培养的新鲜平板上挑取菌落,Phoenix工作流程,在ID肉汤中制成标准浊度（0.50.6麦 氏单位）的菌悬液,加一滴AST指示剂到AST肉汤中,Phoenix工作流程,从ID肉汤管中准确吸取25 L菌悬液， 加入到AST肉汤中,Phoenix工作流程,将肉汤倒入检测板，盖盖子。检测板 已准备好，可以上机检测。,Phoenix工作流程,巧妙的重力加样技术,扫描板条，输入资料,Phoenix工作流程,将检测板放入仪器（随意位置）,Phoenix工作流程,仅需区别革兰氏染色即可选板 板条种类齐全： 鉴定板、药敏板、鉴定药敏复合板 同时提供独立密封包装的鉴定肉汤和药敏肉汤，无需用户配制。 试剂常温保存,配套试剂,强大软件支持： BDXpert微生物专家系统帮助解释和监测检测结果 检测结果分别可分别传入LIS系统或BD Epicenter数据管理系统或打印机，并能进行各种统计学分析,强大的软件系统,鉴定能力 革兰氏阳性菌鉴定180种 革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性菌鉴定200种 革兰氏阴性发酵杆菌 革兰氏阴性非发酵杆菌 无需附加实验 95-96% 准确性,鉴定时间 minimum 1:26 hr maximum 12:25 hr average 3:24 hr median 2:26 hr 95th % 6:26 hr,优异的鉴定性能,检测反应孔内微生物生长情况 浊度（传统方法）： 微生物生长形成小颗粒和聚集成团块 氧化还原作用（BD专利技术） ： 通过药敏实验指示剂颜色变化检测微生物的新陈代谢 浊度与氧化还原的变化通过红、蓝、绿光每20分钟检测一次,药敏实验方法,药敏种类与时间 葡萄球菌属 链球菌 肠球菌属 肠杆菌属 其他革兰氏阴性杆菌 GN - 90% in 5 Hrs GP - 80% in 6 Hrs 药敏特点 对倍稀释药物浓度 真正的MIC检测 延迟耐药检测 急诊报告 快速完成功能,耐药检测无需附加板条 自动检测18种耐药机制 产超广谱Beta内酰胺酶检测(ESBL) 耐甲氧西林葡萄球菌检测(MRS) 链霉素高耐株检测(HLSR) 庆大霉素高耐株检测(HLGR) 耐万古霉素肠球菌检测(VRE) 产Beta内酰胺酶革兰氏阳性菌检测,优异的药敏性能,仪器判读结果,仪器自动记录每次判读的每个反应孔的结果。 将反应结果与上一次判读结果进行比较。 当两次结果没有差别，则该反应结束。 内置的运算法则：颜色比率的变化 依时间而变的数据库：2、3、4、6、12小时，依据每个测试周期的判读结果产生“百分比图”，如获得足够的信息，则给出鉴定结果。 标准菌量,可信度90，给出结果。,BDXpert微生物专家系统,鉴定实验,BDXpert专家 系统 - NCCLS - DIN - SFM - BD Rules,报告 - ID - MI - Rule set SIR - BDXpert SIR - 特殊信息,药敏实验,BDXpert微生物专家系统目的,对药敏结果进行解释与修正，保证药敏实验结果准确可靠，从而指导临床正确进行抗感染治疗 专家规则来自于： 已确定的标准（NCCLS,DIN,SFM) 药物研发单位的文献资料 已广为接受的文献资料和经验 持续更新,BDXpert微生物专家系统规则的应用,SIR结果的解释来自于专家系统规则的设置 NCCLS, DIN, SFM, Custom 药物分级规则 天然耐药和天然敏感规则 耐药标记规则 肠杆菌科： ESBL 葡萄球菌： MRS, beta-内酰胺酶 (GP BL) 肠球菌：VRE, HLGR, HLSR,举例：SIR解释,规则规定 肠杆菌科细菌Ampicillin breakpoints: S8 (I=16) R32 Ref: Table 2A (NCCLS M100-S12, 2002),Phoenix 显示 如果 待检菌是肠杆菌科细菌，且药物为 ampicillin，MIC = 2 那么 结果显示为“S”,BDXpert微生物专家系统规则的应用,举例：天然耐药,规则规定 规则： C. freundii 在体内对ampicillin和 amoxicillin天然耐药 Ref: Brownet, al. 1989J. Antimicrob. Chemother.,Phoenix显示 如果 待检菌是C. freundii 且 AM is “S” or “I” 或 AMX is “S” or “I” 那么 将AM or AMX 结果改为“R”，且报告显示该待检菌是对该抗生素天然耐药；检查鉴定结果和待检菌是否纯,BDXpert微生物专家系统规则的应用,结果显示 鉴定结果 (用户可修改) MIC值 来自标准的解释 BDXpert 专家系统SIR结果 最终结果 (用户可修改),鉴定及药敏结果显示,中文报告系统,TCP/IP 以太网,EpiCenter 工作站,Phoenix ID/AST,BACTEC 9000 Bl