蛋白质的定性定量分析.ppt

第二章 蛋白质的定性定量分析,蛋白质定性分析 (qualitative analysis),确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质,蛋白质定量分析 (quantitative analysis),确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量,蛋白质含量的测定方法（重点掌握）,蛋白质相对分子量测定 (SDS-PAGE),等电聚焦电泳 (IEF)（一般了解）,蛋白质的免疫印迹分析 (western blotting),第一章 蛋白质的含量测定,蛋白质的含量测定,基于蛋白质的 元素组成特点,基于蛋白质的 化学显色反应,基于蛋白质的 光吸收特性,蛋白质元素组成的特点,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此 只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据 以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%,一、紫外光谱 (A280)吸收法,这一方法可用来快速检测溶液中是否含有 蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋 白质的洗脱峰,原 理,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm附近,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法,芳香族氨基酸的紫外吸收,所需时间,几分钟,优 点,快速,缺 点,核酸可引起强干扰作用,灵 敏 度,0.2 mg/ml2 mg/ml,对蛋白质无破坏性,不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液,计算方法,标准曲线法,蛋白质浓度 (mg/ml) =1.45A280-0.74A260,注意事项,石英比色杯,调零所用溶液,配制标准蛋白所用溶液,光密度范围,二、Bradford检测法,这是一种迅速、可靠的通过染色法测定 溶液中蛋白质含量的方法,原 理,该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光吸收值大小计算蛋白的含量,所需时间,10 min,优 点,快速（反应时间仅需2 min）,敏感，几乎没有蛋白质损失,缺 点,用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性,灵 敏 度,25 ug/ml200 ug/ml,对各种纯化蛋白质反应不同,计算方法,标准曲线法,注意事项,标准曲线在2.5 ug15 ug BSA浓度 范围内保持线性关系,反应1015 min后开始出现沉淀， 尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀,若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确,三、Lowry检测法,这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用，在检测之前可通过蛋白质沉淀将干扰物质去除,原 理,首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745 750 nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量,所需时间,40 min,优 点,一种可靠的蛋白质定量方法,不同蛋白质之间差别很小,缺 点,某些试剂不稳定,灵 敏 度,5 ug/ml100 ug/ml,干扰物质多,反应速度慢,使蛋白质发生不可逆变性,计算方法,标准曲线法,注意事项,在加入试剂30 min后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱,许多干扰物质降低颜色反应,高盐浓度可引起沉淀,四、BCA (二喹啉甲酸)检测法,这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质的影响,原 理,在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2生成络合物，同时将Cu2还原成Cu。而BCA试剂可敏感特异地与Cu结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量,优 点,与Lowry法相比几乎没有干扰物质的 影响,缺 点,蛋白质发生不可逆的变性,灵 敏 度,标准检测： 10 1200 ug/ml,单一试剂,终产物稳定,反应时间长,微量检测： 0.5 10 ug/ml,计算方法,标准曲线法,注意事项,与Lowry相比，采用BCA法时， 如果样品中含有脂类物质将明显 提高光吸收值,为促进BCA法的反应进程，可将 样品适当加热,小结（Summary）,掌握常用的测定方法,不同方法的操作步骤,操作过程的注意事项,其它蛋白质的定性定量方法,1. 蛋白质的染色定量,2. ELISA测定,3. 放射免疫测定,第二节 蛋白质相对分子量测定,分子量测定 (molecular weight, MW),排阻层析,沉降平衡超速离心,动态弹性光散射,孔径梯度电泳,质谱 (ESI-MS),一、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量,1. 不连续系统原理,2. SDS-PAGE凝胶的制备,制备分离胶,制备浓缩胶,加样,装板,电泳,卸板并进行凝胶染色,SDS-PAGE,3. SDS-PAGE基本原理,SDS,影响迁移率的因素,十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate),十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate),SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异,SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的荷质比，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系,Watch SDS-PAGE原理,4. SDS-PAGE测定分子量的操作,标准品的选择及处理,待测样品的制备,电泳分离及染色,相对迁移率的计算,Watch SDS-PAGE操作,Analysis for SDS-PAGE electrophoresis,5. 注意事项,选择合适的胶浓度,样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉 淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去,SDS与蛋白质之间的结合程度,蛋白质的分子量范围 15200 KD之间,二硫键是否完全被还原,溶液中SDS的浓度,溶液的离子强度,多亚基蛋白质分子量检测,用其它方法测定分子量进行参照,SDS和巯基乙醇,SDS-PAGE测定的准确性,电荷异常或构象异常,带有较大辅基的蛋白质,某些结构蛋白