蛋白质分离纯化及鉴定.ppt

凝胶过滤层析法 聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质分离纯化及鉴定,凝胶过滤层析法,试验原理,利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。,凝胶层析的原理,Kd=(Ve-Vo)/Vi,优点 条件温和 操作简便 损失少回收率高 层析柱可反复使用,凝胶及凝胶柱的选择 根据不同分子量选择不同凝胶 Sephadex: 交联葡聚糖 G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值 X 10 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶,凝胶柱的选择,凝胶的前处理,溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。 碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。 酸洗：用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。,将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。 将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/41/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。,装柱,样品上柱、洗脱、收集。,如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面 沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。 用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。,凝胶的再生及保存,再生 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处理后可以恢复其性能 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠 或0.002%双氯苯双胍己烷,a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定,应用,聚丙烯酰胺凝胶电泳,1原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N，N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素(VB2)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。,1.1 聚丙烯酰胺凝胶优点 化学性能稳定，对pH和温度变化不敏感； 重复性好； 灵敏度高，可达10-6 g； 分辨率高。,1.2 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关,凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关,1.3 种类 连续系统与不目前常用的多为圆盘电泳(图1)和板状电泳(图2)，两者电泳原理完全相同。 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统两大类。,图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面) (1)样品胶 pH 6.7 (2)浓缩胶 pH 6.7 (3)分离胶 pH 8.9 (4)电极缓冲液 pH 8.3,图2 夹心垂直板电泳槽示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统,图3 蛋白质微型电泳系统,蛋白质微型电泳系统,1.4 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH 6.7的Tris-HC1。 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH 8.9 Tris-HC1。 电极缓冲液是pH 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。,样品浓缩效应 A. 凝胶孔径不连续性 B. 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 C. 电位梯度的不连续性 分子筛效应 电荷效应,1.5 不连续体系凝胶对蛋白的分离作用,2.1 SDS-不连续体系凝胶制备,2. 操作步聚,试剂名称 分离胶 (8%) 浓缩胶 (4%) 分离胶缓冲液 1.25 ml / 浓缩胶缓冲液 / 0.5 ml 水 2.4 ml 1.2 ml TEMED 10 ul 5 ml AP 60 ul 25 ul,聚丙烯酰胺凝胶配制,操作步聚,2.2 样品处理 适量浓度蛋白溶液加入1上样缓冲液混匀，95水浴中处理5分钟。 2.3 加样 用微量进样器取10-15 l上述混合液，通过电极缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。 2.4 电泳 将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源。,2.5 染色